STS: Получение из отдельных фракций геномной ДНК
Одним из наиболее широко используемых источников STS в настоящее время является микросателлитная ДНК. Исторически использование микросателлитной ДНК как источника STS связано с развитием методик генетического картирования и разработкой концепции молекулярно-генетических маркеров. Построение генетических карт человека является одной из наиболее сложных задач генетики в силу того, что, естественно, невозможно проводить необходимые скрещивания. Поэтому для успешного картирования необходимы методы быстрого и надежного анализа возможно большего числа генотипов по возможно большему числу признаков.
Для решения этой задачи потребовалась разработка концепции анонимных маркеров. Анонимный маркер - это фрагмент ДНК , локализованный на генетической карте. При этом не требуется выяснение функции этого фрагмента, необходимо только наличие надежного метода идентификации, информации о том, с какими другими маркерами он сцеплен и возможно большая гетерозиготность соответствующих локусов в популяции.
Наиболее эффективными маркерами в настоящее время являются локусы микросателлитов .
Для человека во многом усилиями Genethon была составлена карта сцепления на основе высокополиморфных динуклеотидных маркеров, которая представляет собой отличную основу для картирования. Первая версия карты содержала 814 маркеров [ Weissenbach J. e. a., 1992 ], в середине 90-х гг она состоит из 2066 маркеров, расположенных в среднем на расстоянии 2,9 сМ друг от друга [ Gyapay G. e. a., 1994 ].
Следующим этапом была разработка автоматизированных методов картирования геномов с использованием коротких тандемных повторов . Еще в 1992 г. Ziegle с соавт. [ Ziegle J.S. e. a., 1992 ] разработали программу GENESCAN-tm 672 для быстрого и точного определения размеров аллелей. Впоследствии фирма Applied Biosystems разработала программу Genotyper-tm , которая позволяет автоматически соотносить информацию о интенсивности флюоресценции продуктов PCR с имеющейся информацией о изученных локусах.
Наличие таких программ и большого объема информации о картировании локусов коротких тандемных повторов позволили перейти к разработке методов полностью автоматического картирования. Одним из примеров таких работ является работа P.W. Reed с соавт. [ Reed P.W. e. a., 1994 ]. Авторы разработали 39 специфичных для определенных хромосом наборов праймеров для быстрого и надежного анализа генотипов исследуемой популяции. Вероятность того, что какой-либо маркер будет удален больше, чем на 20 сМ от ближайшего локуса, идентифицируемого подобранными праймерами, не превышает 4%. Наборы праймеров оптимизированы по следующим параметрам : надежность в реакции PCR, значению PIC (Polymorphism Information Content) и положению на карте соответствующего локуса, и тому, насколько корректно они могут быть автоматически проанализированы программой Genotyper-tm. В каждый набор входят до 9 пар праймеров, размеры аллелей которых не перекрываются. Это позволяет на одной дорожке анализировать до 24 микросателлитов, или до 864 генотипов на стандартном геле.
Авторы доказали высокую производительность этого подхода генетическим анализом 96 пар братьев и сестер вместе с их родителями (всего 384 человека) с целью идентификации генов, определяющих развитие инсулин-зависимого диабета . Полученные карты сцепления соответствовали картам, ранее опубликованным Genethon. Авторам удалось проанализировать около 100 000 генотипов (включая 87 000 при анализе 254 локусов) менее, чем за полгода.
В настоящее время анализ микросателлитов является одним из наиболее быстрых и эффективных методов получения генетических карт. Тем не менее, он не лишен существенных недостатков, главным из которых является сложность получения эффективных праймеров для PCR.
Смотрите также:
