АПФ: каталитические свойства доменов
Каталитические свойства доменов АПФ человека изучали, либо сравнивая свойства соматического и тестикулярного (включающего только один С-домен) ферментов [ Williams ea 1992 , Ehlers ea 1991 ], либо используя мутантные формы фермента, состоящие из одного N- или С-домена, и полноразмерные, имеющие точечные мутации в области предполагаемого активного центра одного из доменов (замена остатков Glu362 или Glu960 на Asp; или остатков His361 и His365 в N- домене или His959 и His963 в С-домене на Lys) [ Wei ea 1991 ].
По исследованным энзиматическим свойствам мутанты, представляющие собой один из доменов, соответствовали полноразмерным мутантам с интактным аналогичным доменом и инактивированным вторым доменом.
Природная изоформа АПФ из "кишечной жидкости" человека [ Deddish ea 1994 , Deddish ea 1996 ] по профилю активации ионами хлора и по отношению к субстратам соответствовала мутантному N-домену. Полученные из АПФ почек человека фрагменты, соответствующие N- и С-доменам [ Sturrock ea 1997 ], по кинетическим характеристикам также были близки мутантным доменам.
Исследования, проведенные на полученных мутантных ферментах (шесть различных мутантов, каждый из которых имел только один интактный домен), позволили выявить различия доменов [ Wei ea 1991 , Wei ea 1992 , Jaspard ea 1993 ].
Так, ионы хлора в существенно большей степени влияли на активность С-домена, чем N-домена. В отсутствие ионов хлора все мутанты, содержащие интактный С-домен, были практически неактивны; максимальная активность наблюдалась при довольно высокой концентрации ионов хлора(до 800 мМ в зависимости от субстрата).
В то же время N-домен сохранял активность в отсутствие ионов хлора и максимально активировался при весьма низкой их концентрации (10-15 мМ). Можно предполагать, что ионы хлора являются фактором, определяющим вклад каждого домена в общую активность фермента. При нормальных физиологических условиях в крови (концентрация ионов хлора около 100 мМ) С-домен, вероятно, ответствен за большую часть превращения ангиотензина I.
Каждый из доменов гидролизовал одинаковые пептидные связи во всех исследованных пептидах, но с разной скоростью. Так, от ангиотензина I и трипептида Hip-His-Leu C-концевые дипептиды отщеплялись С-доменом с большей скоростью, чем N-доменом ( табл.3 ), хотя значения Кm для обоих доменов были практически одинаковы [ Wei ea 1991 ]. Кинетические же константы отщепления от брадикинина последовательно дипептидов Phe8-Arg9 и Ser6- Pro7 были близки для обоих доменов [ Jaspard ea 1993 ]. При сравнительном исследовании расщепления обоими доменами и полноразмерным АПФ различных энкефалинов [ Deddish ea 1997 ] было обнаружено, что пятичленные [Leu5]- и [Met5] энкефалины расщеплялись быстрей С-доменом, но в гептапептиде Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Arg-Phe связь Met5-Arg6 гидролизовалась быстрее N-доменом, причем число оборотов фермента в отношении этого субстрата (7600 мин-1) было самым высоким по сравнению со всеми известными природными субстратами АПФ. Весьма вероятно, что in vivo в превращении гептапептида в [Met5] энкефалин N-домен АПФ играет преимущественную роль.
Специфичным для N-домена природным субстратом оказался пептид N-AcSer-Asp-Lys-Pro , тормозящий гемопоэз [ Rousseau ea 1995 ]; С-доменом этот пептид гидролизовался в 50 раз медленнее. Это обусловлено различием величин Kсat, так как значения Кm для гидролиза этого пептида нативным ферментом и полноразмерными мутантами, содержавшими активный N- и С-домен, были близки. Поскольку нативный АПФ и мутант с активным только N-доменом гидролизовали AcSer-Asp-Lys-Pro почти с одинаковой скоростью, а торможение АПФ in vivo приводило к резкому увеличению концентрации пептида в плазме [ Azizi ea 1996 ], можно предполагать, что и в организме расщепление пептида происходит главным образом N-доменом. Люлиберин гидролизуется обоими доменами, но отщепление N-концевого трипептида N-доменом происходит с существенно большей скоростью (в 30 раз), чем С-доменом [ Jaspard ea 1993 ]. Моноклональные антитела, ингибирующие активность N-домена, тормозили гидролиз люлиберина нативным полноразмерным ферментом более чем на 90% [ Danilov ea 1994 ], что подтверждает преимущественное расщепление люлиберина N-доменом и в нативном ферменте. С результатами, полученными на мутантных ферментах, согласуются ранее имевшиеся данные о существенно большей скорости отщепления N-концевого трипептида люлиберина соматическим АПФ по сравнению с тестикулярным ферментом (87% гидролиза происходило за счет N-домена соматического АПФ) [ Williams ea 1992 , Ehlers ea 1991 ]. Тестикулярный же фермент отщеплял преимущественно С-концевой трипептид [ Ehlers ea 1991 ]. Таблица 4 .
Специфичные (производное цилазаприлата ) и 351А (аналог лизиноприла), различавшихся длиной боковой цепи, с N- и С-доменами разных изоформ АПФ подтвердило предположение [ Wei ea 1992 , Danilov ea 1994 ] о существовании структурных различий между активными центрами доменов.
Было обнаружено, что с С-доменом связывались оба ингибитора, а с N-доменом связывался только один из них (Ro31-8472), имеющий меньшие размеры [ Perich ea 1992 ].
Используемые в клинике ингибиторы эффективно тормозят активность обоих доменов(Ki порядка #10-9М) ( табл.4 ). Однако если при взаимодействии с N-доменом они по эффективности образуют ряд
каптоприл > эналаприлат > лизиноприл (что также отражает зависимость эффективности взаимодействия от длины боковой цепи), то для С-домена порядок был обратным [ Wei ea 1992 ]. В зависимости от преимущественного взаимодействия ингибиторов АПФ с одним из двух активных центров может варьировать их биологический эффект при применении их как лекарств. Так, предполагается, что более высокая эффективность применения периндоприла по сравнению с эналаприлом при диабетической экспериментальной невропатии крыс обусловлена преимущественным торможением им С-домена [ Duggan ea 1996 ]. Различающаяся же специфичность ингибиторов (каптоприл, эналаприлат, делаприлат) по отношению к АПФ из разных тканей, по всей вероятности, обусловлена разной степенью гликозилирования АПФ разных органов [ Bevilacqua ea 1996 ].
Смотрите также:
