Липопротеины: холестерин ЛПВП, количественный анализ
Количественный анализ холестерина ЛПВП проводят путем осаждения ЛПОНП и ЛПНП с последующим определением холестерина в надосадочной жидкости, содержащей ЛПВП. Идеальным методом был бы такой, который позволял бы полностью удалять все липопротеины за исключением ЛПВП. К сожалению, существующие в настоящее время методы преципитации страдают тем недостатком, что в осадке во всех случаях оказывается и подкласс ЛПВП (ЛПВП1), состоящий из частиц, богатых апо Е. Сохранить ЛПВП1, среди остальных подклассов ЛПВП позволяет метод препаративного ультрацентрифугирования. Однако, полученный в результате ультрацентрифугирования плазмы препарат ЛПВП (d 1,063 - 1,21) иногда бывает загрязнен ЛП(а), и значения холестерина ЛПВП оказываются завышенными, тогда как при осаждении ЛП(а) удаляются из надосадочной жидкости весьма эффективно.
При проведении программных исследований липидов холестерин ЛПВП определяли по следующей схеме. К плазме добавляли гепарин в количестве 200 единиц (по международной классификации) на каждый мл, а также MnCl2 до конечной концентрации 46 мМ. Смесь инкубировали на льду в течение 30 мин, а затем центрифугировали 30 мин при 1 500 g (+4 С). Аликвоты надосадочной жидкости использовали для анализа содержания холестерина с учетом разведения каждого мл пробы О,1 мл реагентов.
Более полного осаждения апо В-содержащих липопротеинов удается достичь добавлением MnCl2 до конечной концентрации 92 мМ, причем наибольший эффект наблюдается в случае плазмы, хранившейся в течение нескольких дней. К сывороткам, которые анализируются этим модифицированным методом, необходимо с самого начала добавлять ЭДТА.
Недостатком обоих методов является то, что ионы марганца иногда мешают последующему ферментативному определению холестерина. Этот недостаток устраняется добавлением ЭДТА к растворителям, применяемым в анализаторах. Другой отрицательный момент связан с невозможностью полного осаждения ЛПОНП в образцах, содержащих много триглицеридов. Это вынуждает либо удалять всплывающие агрегаты ЛПОНП фильтрованием, либо разбавлять и даже ультрацентрифугировать образец перед процедурой осаждения.
Все перечисленные проблемы разрешаются, если вместо MnCl2 добавлять к плазме или сыворотке декстрансульфат (М.в. 50 000) и MnCl2 до конечных концентраций О,91 мг/мл и 45 мМ, соответственно ( Bachorik P.S. ea, 1986 ).
Значения холестерина ЛПВП, получаемые с помощью как этого, так и модифицированного метода с гепарином и марганцем, практически идентичны. Совмещение описанных процедур осаждения с автоматизированным ферментативным анализом холестерина позволяет довести коэффициент вариабельности до < 4 % [5].
Смотрите также:
