ДНК изгибы, связанные с А-трактами: метод лигирования и электрофореза
Наиболее прямое доказательство статических изгибов, присущих А-трактам, следует из работ по лигированию олигомеров, содержащих А-тракты разной длины. Чтобы изучать влияние нуклеотидной последовательности на способность ДНК образовывать изгибы систематически, последовательности олигонуклеотидов конструировали таким образом, чтобы их длина соответствовала приблизительно 1 или 2 (реже 3) виткам спирали ДНК (мономеры олигонуклеотидов по 10, 21 или 31 нп, что соответствовало предполагаемому периоду в 10, 10.5 или 10.3 нп) и содержали гипотетический изгиб.
Смесь таких олигонуклеотидов подвергали лигированию вплоть до образования мультимеров из 10 - 20 мономеров исходных олигонуклеотидов и проводили сравнительный анализ их подвижности при электрофорезе в полиакриламидном геле. Чем больше мономеров было лигировано, тем значительнее электрофоретическая задержка в геле, при условии, что последовательность индуцировала изгиб, причем соответствующий мотив находился в одной и той же фазе по отношению к периоду спирали ( Hagerman, 1985 ). Детальный анализ сравнительным электрофоретическим методом выявил условия для максимального проявления изогнутости. Изучали поведение серии (АmNk)n, где N - любой нуклеотид, что такое NB олигонуклеотидов как функции m,k,n. Последовательность А6N5 при повторе n=15 имела самую заметную задержку в геле. Коэффициент задержки достигал величин в 2.5 и 3 единицы при комнатной температуре и пониженной (7 градусов C) температурах ( Koo et al, 1986 ).
Другие методы методы также подтверждают присутствие изгиба в А трактах, а именно:
методом двойного лучепреломления подтверждено наличие равновесного изгиба фрагмента ДНК в растворе, имеющего аномальную подвижность в полиакриламидном геле ( Hagerman, 1984 );
электронномикроскопическая визуализацияи миниколец кинетопластной ДНК и их искривленных фрагментов свидетельствует о загибании в кольцо линейных фрагментов длиной порядка 200 нп ( Griffith et al, 1986 ), причем их связь с антибиотиком дистамицином уменьшает кривизну.
Смотрите также:
