Сверхспирализация: тестирование интеркалирующим красителем
Титрование сверхвитков интеркалирующим красителем - метод определения числа сверхвитков t в препарате кольцевой замкнутой ДНК ( Bauer W. and Vinograd J., 1968 ). Этот метод применим лишь для отрицательно сверхспирализованной кольцевой замкнутой ДНК.
Молекулы некоторых красителей обладают способностью встраиваться между парами оснований двойной спирали при связывании с ДНК, уменьшая угол спирального вращения между этими парами. По мере связывания все большего числа молекул лиганда с отрицательно сверхспирализованной ДНК происходит постепенное снятие напряжений в молекуле, при этом ось двойной спирали "расправляется". Это приводит к уменьшению подвижности молекулы, которое нетрудно зарегистрировать экспериментально. Затем, после того как число связанных молекул лиганда в расчете на пару оснований, n, превысит величину
n = 360*t/(f *N) (1), где f соответствует изменению угла между соседними парами при встраивании между ними молекулы лиганда, напряжения в ДНК вновь начинают расти. Это приводит к увеличению подвижности молекулы. В результате кривая зависимости, например, константы седиментации от числа связанных молекул лиганда имеет минимум ( Рис. Зависимость константы седиментации КЗ ДНК SV40 от n ). Определяя значение n в минимуме и подставляя в формулу (1), можно найти t если известно значение f. Для молекул бромистого этидия, который наиболее часто используется для титрования сверхспирализованной ДНК, f = -26 градусов. Число связанных молекул лиганда можно найти с помощью спектральных методов ( Bauer W. and Vinograd J., 1968 ). К недостаткам этого подхода следует отнести его сравнительную трудоемкость.
Смотрите также:
.gif)