Триплексы: специфичность образования
Часто для прикладных задач необходимо, чтобы олигонуклеотид связался с ДНК в одном или нескольких соответствующих его последовательности сайтах и, по-возможности, не образовывал комплексы с ДНК ни в каких других местах. Но реально олигонуклеотид связывается с полностью специфическим сайтом, а также с сайтами, отличающимися от него на один или несколько нуклеотидов, что может привести к нежелательным эффектам. Возможность избавиться от неспецифического связывания зависит от того, насколько триплекс дестабилизируется неправильными триадами ( Roberts R.W. and Crothers D.M., 1991 ).
Можно выделить три основных типа ошибок в узнавании (см. Рис. Типы ошибок при образовании триплексов ) олигонуклеотидом двухцепочечной ДНК. В первом случае ошибка представляет собой неправильное спаривание в середине сайта, при этом образуется неправильная триада, во втором - образуется тройная спираль со всеми правильными триадами, но одно из оснований олигонуклеотида выпетливается. В третьем случае неправильная триада находится на конце сайта.
Проигрыш в свободной энергии по сравнению с каноническим триплексом в первом случае будет самым высоким, поскольку при таком расположении неправильной триады нарушается стэкинг оснований в триплексе и в структуре появляются две лишние границы. Во втором случае, как правило, ошибка вносит меньший вклад в дестабилизацию, чем в первом, поскольку выпетливание олигонуклеотида меньше нарушает стэкинг оснований, чем неправильная триада. В третьем случае неправильная триада не создает лишних границ в структуре и эффект почти эквивалентен уменьшению длины триплекса на один нуклеотид; поэтому из всех трех видов ошибок эта меньше всего дестабилизирует триплекс.
Неправильные триады разного нуклеотидного состава вносят разный вклад в энергию дестабилизации триплекса, поскольку неканонические основания третьей нити могут в разной степени участвовать в стекинг-взаимодействиях, а некоторые из них образуют по одной водородной связи. Наличие таких связей было показано ЯМР ( Macaya R.P. ea, 1991 , Wang E. ea, 1992 ). Видимо, окружение неправильной триады также играет большую роль ( Frank-Kamenetskii M.D. and Mirkin S.M., 1995 ).
Существует несколько подходов к проблеме неспецифичности связывания олигонуклеотидов. Во-первых, поскольку скорость образования специфических комплексов больше, чем неспецифических, а свяывание обычно проводят при большом избытке олигонуклеотида по отношению к сайтам, можно проводить реакцию не до конца, не дожидаясь полного заполнения специфического сайта. Тогда процент неспецифического связывания будет меньшим.
Другой подход к этой проблеме, в случае, когда необходимо связать олигонуклеотид с двухцепочечной ДНК в единственном месте, может состоять в использовании олигонуклеотида намного большей длины, чем статистически уникальная длина сайта для данной молекулы. При этом с большой вероятностью сайты с одной или несколькими ошибками на этой ДНК вообще не встретятся. Такой подход был применен в работе Strobel S.A. and Dervan P.B., 1991 . Но это возможно, только если последовательность заранее известна, и в ней найдется гомопурин-гомопиримидиновый участок нужной длины, что, к сожалению, маловероятно. В данной работе такой участок пришлось специально клонировать.
Возможно также повысить специфичность, работая в диапазоне условий, когда специфичный комплекс еще достаточно стабилен, а неспецифический уже нет. Например при температурах, близких к температуре плавления, или используя дестабилизацию ДНК формальдегидом. Но диапазон таких условий оказывается узким и время жизни специфических комплексов в таких условиях также оказывается малым ( Roberts R.W. and Crothers D.M., 1991 ).
Интересный метод повышения специфичности межмолекулярных триплексов, основанный на конкуренции, был предложен в работе ( Roberts R.W. and Crothers D.M., 1991 ). Для того, чтобы исключить образование комплекса олигонуклеотида с неспецифическим сайтом, связывание проводилось в условиях, когда олигонуклеотид мог обратимо участвовать в образовании конкурирующей структуры, менее энергетически выгодной, чем полностью специфичный триплекс, но более выгодной, чем триплекс с неправильными триадами. В качестве конкурирующей структуры была использована внутримолекулярная шпилька , образуемая самим олигонуклеотидом. Аналогичное инги- бирование неспецифического связывания было продемонстрированно в той же работе на другом примере, где в качестве конкурирующей с триплексом структуры выступал межмолекулярный дуплекс (см. Рис. Ингибирование неспецифического связывания ).
Смотрите также:
