ПНК: подавление экспрессии генов в экспериментах in vivo
Несмотря на высокую интенсивность исследований тройных спиралей , примеры их успешного применения для подавления экспрессии генов in vivo на сегодняшний день немногочисленны. Постел и соавторы ( Postel E.H. ea, 1991 ) использовали 27-членный олигонуклеотид, связывающийся в антипараллельной ориентации с участком -153/-117 промотора Р1 гена c-myc человека. В этом участке расположен один из сайтов узнавания транскрипционного фактора PuF. В предварительных экспериментах было показано, что связывание олигонуклеотида приводит к ингибированию транскрипции в клеточном экстракте ( Cooney M. ea, 1988 ). Обработка культуры клеток HeLa тем же олигонуклеотидом in vivo частично защищала место связывания от гидролиза ДНКазой I и в несколько раз снижала равновесный уровень мРНК c-myc. Контрольный олигонуклеотид идентичного состава, не способный связываться с промотором Р1, подобного эффекта не вызывал. Подавления экспрессии гена c-myc в клетках MCF-7 с помощью 37-членного GT-содержащего олиго- нуклеотида, направленного к той же последовательности-мишени, удалось добиться и другой группе авторов ( Thomas T.J. ea, 1995 ). Однако, в последнем случае эффект проявлялся только в присутствии в культуральной среде полиамина 1,3-диаминопропана, стимулирующего образование тройного комплекса.
Орсон и соавторы ( Orson F.M. ea, 1991 ) продемонстрировали небольшое ингибирование in vivo транскрипции гена a- субъединицы рецептора интерлейкина-2 при воздействии на клетки 28-членным GT-содержащим олигонуклеотидом, связывающимся параллельно в промоторной области гена. По-видимому, ингибирование происходило за счет вытеснения транскрипционого фактора NFkВ со своего сайта узнавания.
В работе Федосеевой и соавторов ( Fedoseyeva E.V. ea, 1994 ) описано блокирование индукции интерфероном g экспрессии MHC- II на поверхности клеток человека, вызванное специфическим связыванием олигонуклеотида с промотором гена MHC-II. Интересно, что одновременно оказывалась блокированной индукция двух других генов, ICAM-I и Fc-рецептора, в норме реагирующих на интерферон g. Авторы предполагают, что интерферон-зависимые регуляторные элементы промоторов этих генов в силу гомологии первичных структур также могут связывать добавляемый олигонуклеотид и переходить в неактивное состояние.
Уменьшение уровня экспрессии мРНК гена множественной устойчивости к лекарственным препаратам mdr1 было зафиксировано в экспериментах с лейкемическими Т-лимфобластами человека при обработке клеток GT-содержащим немодифицированным 27-членным олигонуклеотидом ( Scaggiante B. ea, 1994 ). Предварительно было показано параллельное связывание этого олигонуклеотида с AG- богатым участком кодирующей области гена mdr1 при физиологических условиях.
Мак-Шен и соавторы ( McShan W.M. ea, 1992 ) проводили испытания GT-содержащих олигонуклеотидов, направленных к участкам инициации транскрипции (-16/+13) и связывания фактора Sp1 (-81/-44) в промоторе вируса HIV-1. Модифицированные аминогруппой в 3'- положении олигонуклеотиды добавляли к зараженным вирусом клеткам МТ4 и U937. Авторы наблюдали заметное снижение титра вируса, ослабление цитопатических проявлений инфекции и подавление экспрессии полноразмерной РНК HIV-1 и вирусных антигенов.
В нескольких работах было показано ингибирование экспрессии на моделях искусственных комбинаций генов-репортеров и элементов природных промоторов, содержащих последовательности-мишени тройных спиралей. Котрансфекция клеток плазмидами, несущими такие гибридные конструкции, и олигонуклеотидами, предназначенными для формирования тройных спиралей, в ряде случаев ( Roy C., 1994 , Ing N.H. ea, 1993 , Lu G. and Ferl R.J., 1992 ) приводила к снижению экспрессии гена-репортера.
Следует отметить, что результаты экспериментов с тройными спиралями in vivo не всегда согласуются с данными, полученными in vitro. Пример такого расхождения приведён в сообщении Свинарчука и соавторов ( Svinarchuk F. ea, 1996 ). Стабильное связывание 13- членного гомопуринового олигонуклеотида с промотором протоонкогена с-pim-1 мыши in vitro сопровождалось частичным ингибированием транскрипции при внесении в клетки сформированного тройного комплекса. Однако, если модельную плазмиду с промотором гена с-pim-1 вносили в клетки заранее, то добавление олигонуклеотида не приводило к образованию комплекса in vivo и никак не влияло на транскрипцию.
Недавно в литературе появился пример усиления экспрессии гена ( Neurath M.F. ea, 1995 ) вследствие образования тройной спирали. Авторы идентифицировали участок связывания для нового транскрипционного фактора NF-aP вблизи сайта узнавания известного фактора BSAB в 3'альфа-энхансере генов тяжелых цепей иммуноглобулинов. Связывание двух факторов во всех исследованных случаях оказывалось взаимоисключающим, причём связывание BSAB отрицательно влияло на активность энхансера. Обработка клеток олигонуклеотидом, образующим тройную спираль в сайте узнавания BSAB, избирательно блокировало связывание этого фактора. Отсутствие белка BSAB, в свою очередь, создавало благоприятные условия для связывания NF-aP и усиления активности энхансера, сопровождавшегося увеличением уровня эндогенной экспрессии различных форм иммуноглобулинов.
Во всех рассмотренных экспериментах формирование тройных спиралей осуществлялось при помощи синтетических олигонуклеотидов. Немодифицированные олигонуклеотиды обладают по отношению к большинству клеток млекопитающих низкой проникающей способностью и малым (несколько часов) внутриклеточным временем жизни. В настоящее время идет активный поиск различных модификаций сахаро-фосфатного остова и других изменений химической структуры молекулы олигонуклеотида, которые, не нарушая его способности к образованию тройной спирали, облегчили бы прохождение через клеточную и ядерную мембраны и позволили бы избежать атаки клеточных нуклеаз.
Как показали проведённые исследования, замена фосфо- диэфирных межнуклеозидных связей на метилфосфонатные ( Kibler-Herzog L. ea, 1990 ) или фосфоротиоатные ( Kim R.A. ea, 1992 и Svinarchuk F. ea, 1996 ) существенно улучшает показатели проникновения в клетку и времени жизни модифицированных молекул, хотя и несколько ослабляет устойчивость тройных спиралей. Весьма перспективными являются работы с так называемыми "пептидо- нуклеиновыми" кислотами ( ПНК ), имеющими пептидный тип связей между нуклеозидами. Тройные спирали с пептидо-нуклеиновыми молекулами, как правило, намного стабильнее тройных спиралей обычного типа ( Larsen H.J. and Nielsen P.E., 1996 ). Хорошо зарекомендовали себя также 3'-амино- ( McShan W.M. ea, 1992 , Svinarchuk F. ea, 1996 ) и 5'-акридиновые ( Grigoriev M. ea, 1992 ) производные природных олигонуклеотидов.
Нунберг и соавторы ( Noonberg S.B. ea, 1995 ) предприняли попытку использования устойчивых к нуклеазам a-форм аномерных конфигураций нуклеозидов в олигонуклеотидах. Устойчивость тройных комплексов с CT- и GT-содержащими a-аномерами олигонуклеотидов оказывается сравнимой с устойчивостью природных комплексов, в то время как AG-содержащие a-аномеры не могут участвовать в формировании тройных спиралей.
Для получения дополнительных сведений, касающихся структуры, свойств и применения тройных спиралей, мы отсылаем читателя к всеобъемлющей монографии Сойфера и Потамана ( Soyfer V.N. and Potaman V.N., 1996 ).
Смотрите также:
