ПЦР: видовая идентификация микобактерий
Метод ПЦР может быть достаточно эффективен для быстрой идентификации микобактерий туберкулезного комплекса и некоторых видов нетуберкулезных микобактерий после получения их первичного роста. В этом случае использование ПЦР может экономить 7-10 дней, необходимых для последующей культуральной идентификации положительного результата. Исследование методом ПЦР является технически очень простым, поскольку не требует сложной пробоподготовки клинического материала для достижения высокой чувствительности. При исследовании 80 положительных в такой тест-системе (MB ВасТ фирмы Organon) культур все положительные результаты ПЦР-анализа были строго специфичны и проводились в течение 1 дня. Для идентификации других видов микобактерий при получении их в культуре ДНК возбудителя гибридизуется со специфическими ДНК-зондами, меченными акридином, и штаммы детектируют по появлению хемилюминесценции с помощью хемилюминометра или на полосках нитроцеллюлозы с визуальной оценкой после гибридизации. С помощью такого набора идентифицируют ограниченное число видов: комплекс микобактерий туберкулеза M. tuberculosis , M. avium , M. avium complex , M. kansasii и M. gordonae .
A.Telenti и соавт. разработали также относительно простой и недорогой метод видовой идентификации клинически важных видов микобактерий на основе ПЦР и последующей обработки двумя рестрикционными ферментами (ферменты, обладающие свойствами рассечь молекулу ДНК в специфических точках). При этом амплифицируют фрагмент ДНК, кодирующий белок теплового шока (65 кДа) , после чего обрабатывают полученный в ПЦР фрагмент ДНК размером 439 нуклеотидных пар раздельно двумя ферментами - Bste II и Нае III. Затем анализируют, используя агарозный гельэлектрофорез, полученные два продукта, определяя их размеры (число нуклеотидных пар) с помощью набора стандартных фрагментов ДНК (молекулярных ДНК-маркеров) длиной от 100 до 1000 нуклеотидных пар. В каждом из определенных видов ( M. tuberculosis , M. avium , M. intracellulare , M. kansasii , M.fortuitum ) обнаруживают 2 или 3 фрагмента ДНК различного размера для каждого рестрикционного фермента. Комбинация получаемых различного размера фрагментов ДНК позволяет дифференцировать эти виды между собой.
Разрабатывается технология биологических ДНК-микрочипов. которая поможет идентифицировать более 100 видов микобактерий в одном исследовании.
Видовая идентификация может быть проведена также с помощью ПЦР- амплификации вариабельной области 16S rРНК с последующим секвенированием ампликонов при сравнении с соответствующей первичной структурой, что позволяет идентифицировать более 40 видов микобактерий.
С помощью ПЦР может быть также проведена видовая идентификация внутри комплекса микобактерий туберкулеза, в том числе дифференцирование M. bovis и M. bovis BCG . Для этого анализируется наличие или отсутствие некоторых генов в геномных областях RD1 , RD9 и RD10 . RD1 отсутствует в М. bovis BCG, но присутствует в вирулентных видах, в том числе в M. bovis. На рис. 13-11 представлена электрофореграмма, демонстрирующая отличия М. bovis BCG от вирулентных видов.
Смотрите также:
