ПЦР: выделение ДНК микобактерий туберкулеза из клинических образцов
Для проведения ПЦР молекулы ДНК возбудителя должны быть выделены из биологического материала в минимальном объеме, при минимальном количестве неспецифической ДНК и различных ингибиторов фермента - ДНК- полимеразы.
Подготовка проб должна проводиться в условиях, предотвращающих перекрестное загрязнение исследуемых образцов выделяемыми молекулами ДНК. Для этого необходима предварительная обработка помещения ультрафиолетом, полов и рабочих поверхностей столов и приборов - хлорсодержащими растворами. Также необходимо обязательное использование чистых перчаток, одноразовых пробирок и наконечников к автоматическим пипеткам.
Для выделения ДНК микобактерий туберкулеза из клинических образцов (спинномозговая жидкость, бронхиальный смыв), не содержащих большого числа лейкоцитов, клеточного детрита или солей, достаточно центрифугировать пробу при 3-4 тыс. оборотов в минуту, добавить к осадку 20-30 мкл 2% раствора тритона Х-100 и прогреть при 90*С в течение 30 мин.
Для подготовки проб мокроты необходимо эффективное разжижение, для которого обычно используют 4% раствор натрия гидроксида и N-ацетил-L- цистеин (NALC) в количестве 50-80 мг на пробу - в зависимости от вязкости образца. Раствор NALC должен быть приготовлен ex tempore либо порошок NALC можно добавить в сухом виде непосредственно в пробу. После разжижения необходимо центрифугирование проб в течение 15 мин при 3,5-4 тыс. оборотов в минуту (3000 g) в пробирках объемом 50 мл с завинчивающимися крышками, т.е. в тех же условиях, которые рекомендуются для предпосевной подготовки мокроты.
Для экстракции ДНК из осадка чаще применяют метод, основанный на использовании 5-6-молярного раствора гуанидин-изотиоцианата в качестве лизирующего реагента и микропористых частиц оксида кремния ("диатомовая земля"), сорбирующих молекулы ДНК. Неспецифические вещества, в том числе возможные ингибиторы, затем отмывают в 2,5-молярном растворе гуанидин- изотиоцианата и растворе этанола, после чего десорбируют молекулы ДНК в воде, и эти образцы используют для проведения ПЦР. Для упрощения технологии выделения ДНК "диатомовую землю" нередко заменяют магнитными микрочастицами, покрытыми оксидом кремния. При этом для осаждения частиц вместо центрифугирования применяют специальный магнитный штатив для микропробирок.
В России разработан оригинальный метод иммуномагнитной сепарации микобактерий с последующей экстракцией ДНК возбудителя. Для иммуномагнитной сепарации микобактерий туберкулеза используют феррочастицы размером 3-5 мкм, покрытые оксидом кремния, к которым присоединены посредством химической связи поликлональные (кроличьи) антитела к микобактериям туберкулеза. Образцы мокроты после щелочного лизиса нейтрализуют кислым раствором трис-HCl и инкубируют с иммуномагнитным сорбентом. Затем иммуноферрочастицы собирают с помощью магнитной палочки со сменным наконечником, переносят в микропробирку, осаждают, вносят 20-30 мкл 2% раствора тритона Х-100 и прогревают 30 мин при 90*С. Надосадочную жидкость используют в качестве ДНК-матрицы для ПЦР-анализа.
Сложной проблемой является выделение ДНК микобактерий туберкулеза из биоптатов. Для лизиса биоптата используют фермент протеиназу К в конечной концентрации 200-500 мг/л при температуре 56*С в течение ночи. Далее выделяют одним из известных методов. Избыток неспецифической ДНК при ПЦР-анализе биоптатов нередко служит причиной ингибирования реакции, что требует повторного экстрагирования ДНК.
Смотрите также:
