S1-картирование РНК и ДНК
Нуклеаза S1 , специфически гидролизующая одноцепочечные ДНК и РНК, используется для исследования колинеарности ДНК и кодируемой РНК, точного картирования мест инициации и терминации транскрипции на ДНК-матрицах, а также для оценки гомологии между двумя молекулами ДНК или РНК. Для обнаружения интронов в изучаемых генах клонированный в составе геномной ДНК ген гибридизуют со зрелой РНК, кодируемой этим геном. При наличии в гене интронов их последовательности в ДНК-РНК-гибридах освобождаются в виде одноцепочечных участков и могут быть специфически гидролизованы S1-нуклеазой. При электрофоретическом разделении продуктов гидролиза в денатурирующих условиях при наличии интронов наблюдают появление фрагментов ДНК, причем на основании размеров фрагментов можно локализовать положение интронов в гене. Такой же подход используется и для анализа гомологии между двумя последовательностями нуклеиновых кислот или обнаружения мутаций.
Использование S1-нуклеазы позволяет с точностью до одного- двух нуклеотидов картировать положение точек инициации и терминации транскрипции внутри гена. И в этом случае короткие меченые фрагменты 5'- или 3'-концевых частей гена, заключающие в себе указанные последовательности ДНК, гибридизуют с исследуемыми РНК и образовавшиеся ДНК-РНК-гибриды инкубируют с S1-нуклеазой. Электрофоретическая подвижность полученного фрагмента ДНК, защищенного от действия S1-нуклеазы концевой частью анализируемой РНК, сравнивается с таковой фрагментов того же участка ДНК, образующихся при его секвенировании по методу Максама-Гилберта . В результате однозначно определяют положение нуклеотидов во фрагментах исследуемых ДНК, которые защищены в ДНК-РНК-гибридах от действия S1-нуклеазы.
Смотрите также:
