Бесклеточные белоксинтезирующие системы: общие сведения
Среди искусственных систем биосинтеза белка важное место занимают бесклеточные системы. Бесклеточные системы создаются для моделирования биохимических процессов, происходящих в живом организме, и воспроизводит некоторые особенности жизнедеятельности клетки. В генной инженерии бесклеточные белоксинтезирующие системы используются для исследования кодирующего потенциала и механизмов экспрессии клонированных генов in vitro, и на промежуточных этапах конструирования рекомбинантных генов для идентификации мРНК или фрагментов ДНК по кодируемым белкам.
Преимуществом бесклеточных систем перед клетками является доступность их компонентов для экспериментальных воздействий. Такие системы позволяют исследовать влияние различных экзогенных факторов на их функционирование (ионные условия, рН, ингибиторы и активаторы и т.п). В бесклеточной системе можно заменять отдельные компоненты или непосредственно воздействовать на них в изолированном состоянии и затем по реакции системы познавать их функциональную значимость. Большинство результатов, полученных с помощью бесклеточных систем, невозможно было бы получить при использовании живых клеток, погибающих при нарушении гомеостаза. Достоинства бесклеточных систем одновременно являются их слабым местом, поскольку после разрушения клеток исчезают многочисленные взаимодействия между их компонентами, благодаря которым можно отличить живую клетку от бесклеточного экстракта.
Бесклеточные белоксинтезирующие системы представляют собой одни из самых сложных и многокомпонентных систем in vitro, используемых в биохимии. Это связано с необходимостью воспроизведения в пробирке всех этапов биосинтеза белка, включая транскрипцию, аминоацилирование тРНК и трансляцию мРНК рибосомами. Тем не менее удается успешно осуществлять процесс биосинтеза белка in vitro и использовать такие системы по трем основным направлениям: для анализа кодирующего потенциала нуклеиновых кислот, исследования механизмов биосинтеза белка и препаративной наработки некоторых рекомбинантных белков и пептидов.
По природе компонентов, которые определяют способность бесклеточных систем осуществлять трансляцию определенных мРНК, принято различать прокариотические и эукариотические системы . Наиболее эффективная трансляция мРНК происходит в гомологичных бесклеточных системах. Под контролем гомологичных регуляторных элементов в бесклеточных системах могут быть успешно транслированы и чужеродные мРНК - транскрипты рекомбинантных генов.
В некоторых бесклеточных системах транслируют предварительно очищенную мРНК или используют эндогенную мРНК, присутствующую в полисомах. В других белоксинтезирующих системах - системах сопряженной транскрипции и трансляции, одновременно происходят синтез мРНК и ее трансляция рибосомами.
Из-за высокой стоимости очищенных компонентов в подавляющем большинстве случаев бесклеточные системы биосинтеза белка используют в аналитическом варианте, когда объем пробы не превышает 100 мкл. Разработаны проточные белоксинтезирующие системы , в которых процесс трансляции удается поддерживать длительное время, непрерывно подводя извне расходуемые вещества, с одновременным удалением синтезируемых белков и продуктов деградации компонентов системы.
Смотрите также:
