Векторы плазмидные: маркеры
Наличие в векторных молекулах селектируемых маркеров повышает эффективность клонирования из-за возможности проведения быстрого отбора рекомбинантных плазмид на селективных питательных средах.
В качестве селектируемых маркеров применяются гены различных ферментов, присутствие которых в клетках в составе плазмиды обнаруживают по появлению соответствующей ферментативной активности. В векторах серии pUC таким селектируемым маркером является 5'-концевая часть гена бета-галактозидазы E. coli - lacZ' ( рис. II.5,б ). Эта часть гена, находящаяся под контролем lac-промотора, кодирует N-концевую часть бета-галактозидазы (так называемый альфа-пептид ), которая путем объединения с недостающей С-концевой частью полипептида без образования пептидной связи восстанавливает ферментативную активность бета-галактозидазы. Бета-галактозидаза обладает способностью расщеплять искусственный субстрат Xgal (5-бром-4-хлор-3-индолил-бета-D-галактопиранозид) с образованием окрашенного в голубой цвет продукта реакции. В том случае, когда в бактериальных клетках, которые содержат в хромосоме недостающую экспрессирующуюся 3'-концевую часть гена lacZ и выращиваются на среде с Xgal, в результате комплементации альфа-пептидом вектора появляется активность бета-галактозидазы, образованные этими клетками бактериальные колонии окрашиваются в голубой цвет. Уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК локализованы в начале гена бета-галактозидазы в составе полилинкера (синтетической последовательности нуклеотидов, содержащей несколько перекрывающихся уникальных сайтов рестрикции), который не нарушает функциональной целостности последовательности нуклеотидов альфа-пептида. Вставка рекомбинантной ДНК в эти векторы разрывает структурную часть гена бета-галактозидазы и инактивирует его, в связи с чем колонии бактерий с подобными рекомбинантными плазмидами, выросшие на питательной среде с Xgal, не окрашены. Поскольку векторы серии pUC одновременно содержат и ген устойчивости к ампициллину , отбор бактерий, несущих рекомбинантные плазмиды, можно проводить одновременно по двум маркерам. На питательной среде с ампициллином и Xgal вырастают только бактерии, устойчивые к антибиотику, т.е. содержащие плазмиду pUC , а среди выросших колоний лишь неокрашенные содержат вставку чужеродной ДНК.
В качестве селектируемых маркеров в векторных молекулах используются гены, присутствие которых косвенно обнаруживается по комплементации генетических дефектов бактериальных клеток-хозяев, что делает их жизнеспособными в определенных селективных условиях.
Смотрите также:
