Клетки насекомых, зараженные бакуловирусами
Семейство бакуловирусов обладает геномом в виде двухцепочечной кольцевой ковалентно замкнутой ДНК длиной в 80-220 т.п.о. Круг хозяев бакуловирусов ограничен членистоногими. Клетки млекопитающих могут быть заражены бакуловирусами только при высокой множественности инфекции. Вирус проникает в клетки, но в них не воспроизводится, не экспрессирует рекомбинантные гены с промоторов насекомых и не способен находиться (персистировать) в клетках животных длительное время.
Интерес к бакуловирусам как потенциальным переносчикам рекомбинантных генов и системам, обеспечивающим их экспрессию, стал возникать после того, как была обнаружена их способность к синтезу большого количества вирусных белков на поздних стадиях инфекции. В частности, это касается вирусных полиэдрина и белка p10 , гены которых находятся под контролем сильных поздних промоторов и которые могут быть удалены без ущерба для размножения вирусов. Поэтому замещение указанных генов рекомбинантными сопровождается усиленной экспрессией последних.
Первоначально использование бакуловирусов с культурами клеток вызывало затруднения из-за экзотичности объекта исследования. Однако с ростом интереса к этим системам экспрессии были разработаны многочисленные варианты рекомбинантных вирусов и векторов на их основе, включая челночные векторы для клеток дрожжей и бактерий. Кроме того, успех этой системы связан с получением удобных линий клеток насекомых. Наиболее часто используемыми клеточными линиями являются IPLB-Sf-21-AE (получена из Spodoptera frugiperda), ее клональная производная Sf9 , а также BTI-TN-5B1-4 и TN368 из Trichopsula ni. Клеточные линии насекомых выращивают в виде суспензионных культур на роллерах и в ферментерах на питательных средах, не содержащих фетальной сыворотки.
Для проявления биологической активности многих рекомбинантных белков требуются посттрансляционные модификации их полипептидных цепей. Оказалось, что клетки насекомых обладают способностью производить большое число таких модификаций, включая гликозилирование, фосфорилирование, ацилирование остатками жирных кислот и амидирование. Рекомбинантные белки могут претерпевать в них адекватный протеолитический процессинг путем удаления сигнальных последовательностей аминокислот и переноситься в соответствующие клеточные компартменты. Были проведены интенсивные исследования механизмов N-гликозилирования в клетках насекомых, которые показали, что хотя оно и происходит, но не соответствует в полной мере таковому клеток млекопитающих.
Смотрите также:
