Методы амбер-супрессии
Для замены определенных аминокислот в полипептидных цепях белков in vivo используют аминоацилированные различными аминокислотами супрессорные тРНК, которые узнают нонсенс-триплеты в мутантных мРНК в процессе трансляции. Взамен аминокислоты, присутствующей в белке дикого типа, встраивается аминокислота, которую несет аминоацилированная супрессорная тРНК. В дополнение к природным супрессорным тРНК E. coli синтезированы in vitro гены, кодирующие супрессорные РНК новой специфичности. В итоге до 13 аминокислотных замен может быть произведено в синтезирующейся in vivo полипептидной цепи в результате супрессии кодона UAG (amber). С использованием такого подхода удалось произвести >1600 замен аминокислот Lac-репрессора E. coli и локализовать участки полипептидной цепи, существенные для связывания индуктора, прочного связывания оператора и термостабильности белка.
Преимуществом метода амбер-супрессии является то, что он не требует синтеза большого числа мутантных генов и их последующего отбора, так как введение одного мутантного гена в составе экспрессирующего вектора в клетки разных супрессорных штаммов E. coli позволяет получать разные замены аминокислот с одновременной сверхпродукцией мутантного белка в бактериальных клетках.
Смотрите также:
