Микроматрицы ДНК: чувствительность метода
Чувствительность метода специфического обнаружения последовательностей ДНК с использованием технологии микроматриц определяется отношением количества зонда, связавшегося со специфической мишенью, к количеству неспецифически связавшегося зонда. Неспецифическое связывание зонда может происходить как с самой подложкой, так и с гомологичными зонду последовательностями нуклеотидов ДНК-мишени с образованием неправильно спаренных оснований. В последнем случае могут быть получены ложноположительные результаты. Поскольку площадь пятна специфической мишени значительно меньше доступной зонду поверхности микрочипа, при малых временах гибридизации количество неспецифически сорбированного зонда будет значительно превышать количество зонда, находящегося в правильных гибридах. Эту ситуацию улучшают путем увеличения времени гибридизации до достижения процессом стационарной фазы. В этой связи интерпретация картин гибридизации требует постановки адекватных контролей для оценки эффективности неспецифического связывания зонда поверхностью микрочипа. Кроме того, для количественной оценки гибридизации необходимо использовать количества зонда, не насыщающие мишени микрочипа во время отжига.
Эффективность детекции флуоресценции является одним из факторов, сдерживающих развитие технологии микрочипов ДНК. По мере уменьшения размеров элементов микроматриц все меньшее количество молекул ДНК-мишени становится доступным зонду. Современные методы позволяют обнаруживать ДНК-мишени в аттомолярных концентрациях (10-18 М) при плотности в одну молекулу ДНК на 1 мкм2 с использованием систем, основанных на конфокальной сканирующей лазерной микроскопии. При определении альтернативных состояний гомологичных последовательностей ДНК- мишеней применяют двухцветные системы. В таких системах один из зондов (специфичный в отношении аллеля дикого типа), метят флуоресцентным красителем одного цвета, а мутантный - другого цвета. Зонды гибридизуют с анализируемым микрочипом, который сканируется при обеих длинах волн, что позволяет обнаруживать тот или иной зонд, сохранившийся в гибриде.
Смотрите также:
