ПЦР в направленном мутагенезе: общие сведения
Использование ПЦР для направленного мутагенеза основано на применении в качестве праймеров олигонуклеотидов, не полностью комплементарных матричной ДНК. Повышенные требования к комплементарности накладываются лишь на последний, 3'-концевой, нуклеотид праймера, но даже в случае 3'-концевой некомплементарности праймеры часто продолжают функционировать в системе ПЦР, хотя и с разной эффективностью. Способность 17- нуклеотидного праймера инициировать ПЦР проявляется при наличии всего восьми нуклеотидов, комплементарных матрице, три из которых расположены на его 3'-конце.
Этот способ применяется для создания в амплифицируемом продукте новых сайтов рестрикции для последующего его клонирования и удобен для встраивания амплифицируемого продукта в экспрессирующий вектор в одной открытой рамке считывания (ОРС) с инициирующим ATG-кодоном вектора. Действительно, экспрессирующие векторы часто содержат 5'-концевую часть будущего рекомбинантного гена, включая регуляторные последовательности, промотор, ATG- кодон и иногда дополнительные кодоны нескольких последующих аминокислот. При конструировании таких векторов в последовательности, следующие за ATG-кодоном, вводят сайты рестрикции, по которым и встраивают фрагмент экспрессируемого гена, кодоны которого (для полноценной экспрессии гена) должны находиться в одной ОРС с ATG-кодоном вектора. Положение природных сайтов рестрикции в клонируемом гене редко отвечает требованиям ОРС вектора, поэтому вводят искусственные сайты рестрикции в клонируемый фрагмент с помощью праймеров, не полностью комплементарных матрице.
Вырожденные праймеры, которые представляют собой сложную смесь олигонуклеотидов, содержащих многие точковые мутации, также используют для сканирования мутациями определенных участков ДНК. В таком классическом варианте постановки ПЦР, кроме точковых мутаций, можно получать делеции и вставки.
Дальнейшим усовершенствованием метода направленного мутагенеза с помощью ПЦР явилась разработка подхода к получению гибридных генов с помощью перекрывающихся праймеров ( рис. II.18 ). Этот метод позволяет не только целенаправленно получать точковые мутации , делеции и вставки , но и гибридные молекулы ДНК без применения ДНК-лигазы.
Смотрите также:
