Рестриктазы: действие на необычные субстраты
Помимо двухцепочечных ДНК многие рестриктазы способны использовать ДНК-РНК-гибриды в качестве субстрата. Это относится, в частности, к рестриктазам EcoRI , HindII , SalI , MspI , HhaI , AluI , TaqI и HaeIII . Некоторые рестриктазы, например, HaeIII , HhaI и SfaI , способны расщеплять одноцепочечную ДНК фага фX174, хотя и со значительно меньшей скоростью, чем соответствующую двухцепочечную RF-форму. Такая способность была продемонстрирована для некоторых других рестриктаз, а также ДНК- субстратов. Остается неясным, узнают ли эти рестриктазы истинные одноцепочечные сайты или же последовательности нуклеотидов, заключенные в элементы вторичной структуры.
С развитием метода ПЦР возникает необходимость расщепления рестриктазами амплифицированных олигонуклеотидов недалеко от их концов, т.е. в условиях, когда сайт рестрикции фланкирован с одного из своих концов одним или несколькими нуклеотидами. В этом случае установлена четкая зависимость способности определенных рестриктаз расщеплять сайты рестрикции от количества фланкирующих сайт нуклеотидов. Данное свойство рестриктаз объясняют, в частности тем, что на самих концах двухцепочечной молекулы ДНК происходит локальное плавление двойной спирали ДНК с образованием коротких одноцепочечных участков, захватывающих сайт узнавания рестриктазами. Частично избежать локальное плавление можно понижением температуры реакционной смеси во время проведения рестрикции таких олигонуклеотидов. Поскольку эти данные имеют большое значение для практической генной инженерии, они суммированы в табл. II.1 .
Смотрите также:
