Рибозимы: лечение вирусных заболеваний (СПИД)
Большие усилия предпринимаются для использования рибозимов в лечении СПИДа, вызываемого вирусами иммунодефицита человека (ВИЧ). В 1990 г. Н. Сарвер и соавторы продемонстрировали возможность расщепления геномной ВИЧ-РНК с помощью рибозима in vitro в бесклеточной системе, что сопровождалось снижением уровня р24-антигена на 98%. Длительные эксперименты на культурах клеток показали, что клетки, экспрессирующие такие рибозимы, не изменяли своего обычного фенотипа на протяжении, по крайней мере, 9 месяцев. Одновременно с этим было показано, что клетки линии MT4 , стабильно трансфецированные вектором, экспрессирующим рибозим под контролем промотора гена тимидинкиназы вируса простого герпеса , были частично устойчивы к ВИЧ-инфекции. Полностью устойчивыми к заражению ВИЧ оказались клетки, содержащие рибозим под контролем вирусного регуляторного элемента tar , в которых вирус не обнаруживали даже через 22 дня после заражения. В этих клетках высокий уровень индукции синтеза рибозима происходит как раз во время ВИЧ-инфекции.
Та же самая стратегия была применена и к рибозимам, образующим структуру типа шпильки . Экспрессия гена рибозима под контролем промотора гена бета-актина подавляла ВИЧ-инфекцию в культивируемых клетках. При этом продукты расщепления ВИЧ-РНК в таких клетках специфически и быстро деградировали.
Еще одним подходом к преодолению ВИЧ-инфекции является отщепление 5'-концевой кэп-структуры ВИЧ-РНК с помощью рибозимов. Известно, что у большинства изолятов ВИЧ 5'-концевая лидерная последовательность их геномной РНК высококонсервативна. Из всех известных изолятов только штамм MN содержит замену одного нуклеотида в лидерной области РНК, расщепляемой рибозимом. В то же время исследованные штаммы ВИЧ различаются по другим участкам 5'-концевой лидерной последовательности. Эндонуклеазное удаление в составе олигонуклеотида 5'-концевой кэп-группы РНК ВИЧ подавляет трансляцию РНК и делает ее более доступной мишенью для внутриклеточных нуклеаз.
Имеющиеся экспериментальные данные позволяют сделать вывод о перспективности использования 5'-концевой лидерной последовательности ВИЧ-РНК в качестве мишени для рибозимов.
Основной сложностью, которую приходится преодолевать при конструировании рибозимов, расщепляющих геномную ВИЧ-РНК, является высокая мутабильность этих РНК. Из-за мутационных замен отдельных нуклеотидов в сайтах, по которым происходит расщепление РНК рибозимами, последние утрачивают свою активность по отношению к этим РНК и соответственно противовирусную активность. Новейшая стратегия в решении данной проблемы заключается в создании нескольких рибозимов, действие которых направлено против разных консервативных участков генома ВИЧ, причем отдельные рибозимы должны входить в одну молекулу рекомбинантной РНК ("метод дробовика"). Помимо последовательностей антивирусных рибозимов такие рекомбинантные РНК содержат в себе дополнительные cis- действующие рибозимы, которые осуществляют аутокаталитический процессинг предшественников антивирусных рибозимов с освобождением зрелых рибозимов, действующих на разные участки вирусного генома. Этот метод не позволяет вирусу ВИЧ избежать инактивирующего действия рибозимов путем мутационных преобразований своего генома.
Была получена кассета из девяти идентичных генов рибозимов, расположенных друг за другом в одном экспрессирующем векторе. Рибозимы такой "полицистронной" РНК, направленные против разных частей ВИЧ-генома, сохраняли внутри клетки свою специфичность, но были более эффективными в пересчете на одну копию РНК полирибозима и не утрачивали своей активности даже в частично деградировавших молекулах РНК.
Смотрите также:
