Системы циклического отбора мутантных ДНК
Хорошо себя зарекомендовали системы циклического отбора мутантных ДНК, содержащие сайт-специфические мутации, в которых используются свойства систем рестрикции-модификации EcoK и EcoB E. coli. Используемые для трансформации штаммы E. coli могут содержать системы рестрикции-модификации EcoK- или EcoB-типа. Если родительскую цепь ДНК для мутагенеза выделяют из клеток, дефектных по метилазам системы модификации, то после достройки комплементарной цепи с мутантного олигонуклеотида такая неметилированная ДНК будет расщепляться системой рестрикции после введения в соответствующий бактериальный штамм. Если одновременно с олигонуклеотидом-мутатором использовать второй олигонуклеотид, изменяющий сайт рестрикции, то лишь ДНК с мутировавшим сайтом рестрикции в результате ошибочного функционирования системы репарации сохранится в бактериальных клетках. Такие ДНК с высокой вероятностью будут содержать и требуемую мутацию.
Описана система, в которой в родительскую цепь ДНК фазмиды вводили вместо остатков тимидина остатки уридина. В этом случае после синтеза дочерней комплементарной ДНК in vitro с использованием мутантного олигонуклеотида в качестве затравки родительская цепь ДНК инактивируется в трансформированных бактериальных клетках с помощью эндогенной урацил-N-гликозилазы, удаляющей из ДНК остатки урацила, что сопровождается частичным гидролизом этой цепи с последующей репарацией брешей по мутантной цепи в качестве матрицы и закреплением введенной мутации.
Смотрите также:
