Аллель-специфическая гибридизация олигонуклеотидов (ASO)
Аллель-специфическая гибридизация олигонуклеотидов (ASO - allele-specific oligonucleotide hybridization).
Фрагменты ДНК, амплифицированные с помощью ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК обследуемых индивидуумов и ДНК дикого типа, денатурируют и иммобилизуют на нитроцеллюлозных или нейлоновых мембранах. Мембрана со специфически связанными нуклеиновыми кислотами называется блотом, если ДНК наносят в виде пятен с помощью микропипетки - дот-блотом. Один дот-блот гибридизуют с олигонуклеотидом (меченным 32Р или флуоресцентной меткой), первичная структура которого соответствует исследуемому аллелю дикого типа (дот-блот-гибридизация). Другой идентичный дот-блот гибридизуют с меченым олигонуклеотидом, соответствующим мутантному аллелю ( рис. II.33 ). Температуры плавления образовавшихся гетеродуплексов и правильных гибридов различаются.
Поскольку в гетеродуплексах имеется ошибочно спаренный нуклеотид, температура их плавления (денатурации) будет ниже, чем у соответствующих правильных гибридов. Подобрав температуру, при которой происходит плавление гетеродуплексов, но не правильных гибридов, можно путем промывки буфером соответствующей температуры избирательно убрать с дот-блотов меченые олигонуклеотиды гетеродуплексов, сохранив олигонуклеотиды правильных гибридов в связанном с ДНК дот-блотов состоянии.
После авторадиографии дот-блот-гибридов, промытых буфером соответствующей температуры, получается следующая картина. В случае гибридизации ДНК дот-блотов с олигонуклеотидным зондом, соответствующим последовательности нуклеотидов нормального аллеля, гибрид сохраняется, если в доте присутствует ДНК дикого типа здорового индивидуума. Гибрид разрушается, если в доте присутствует ДНК индивидуума с мутантным геном в гомозиготном состоянии. В этом случае в результате гибридизации зонда с ДНК обоих аллелей образуются гетеродуплексы, содержащие ошибочно спаренный нуклеотид и обладающие пониженной температурой плавления. Если обследуемый индивидуум гетерозиготен по исследуемому гену и его ДНК заключает в себе как мутантный аллель, так и аллель дикого типа, в результате промывки разрушается гибрид мутантного аллеля, но не аллеля дикого типа, и половина образованных гибридов сохраняется. При использовании в дот-блот-гибридизации олигонуклеотидного зонда, соответствующего мутантному аллелю исследуемого гена, по тем же самым причинам после промывки в жестких температурных условиях гибриды сохранятся в случае ДНК гомозиготных и гетерозиготных по мутантному аллелю индивидуумов, но будут разрушены в пробах с ДНК, содержащей только нормальные аллели.
Смотрите также:
.gif)