Рис 2.34 пат Схема аллель-специфической ПЦР
Схема одной из современных модификаций аллель-специфической ПЦР (а), использованной для идентификации точковой мутации Leiden в геноме человека (б и в). Со всеми аллель-специфическими праймерами использован один и тот же встречный праймер. 3'-Концевые нуклеотиды аллель-специфических праймеров комплементарны мутантному нуклеотиду T (4), нуклеотиду дикого типа C (6), праймер 7 комплементарен нуклеотиду дикого типа своей внутренней частью, а его 3'-концевой нуклеотид не комплементарен матричной ДНК. Для усиления специфичности в праймеры 4 и 6 вблизи 3'-концов введены дополнительные нуклеотиды, некомплементарные матрице. Праймер 4 элонгируется ДНК- полимеразой в присутствии гомозиготной мутантной ДНК, но не ДНК дикого типа (б - дорожки 2 и 3 соответственно), в случае праймеров 6 и 7 наблюдается обратная картина (б и в - дорожки 6,8 и 1,3 соответственно). При наличии мутации в гетерозиготном состоянии все праймеры эффективно элонгируются (б - дорожки 5, 9, в - дорожка 4). Увеличение циклов ПЦР сверх оптимального приводит к образованию продуктов ПЦР в тех пробах, где при меньшем числе циклов они не образовывались (б - дорожки 4,7 и в - дорожка 2), что может служить внутренним контролем. Праймер 7 является универсальным, так как позволяет обнаруживать почти любую гомозиготную точковую мутацию, попадающую в его внутреннюю часть. Использование пар праймеров 4 и 6 или 4 и 7 позволяет легко дифференцировать гомозиготные и гетерозиготные мутации.
Ссылки на рисунок:
