ИЛ-2 рекомбинантный (rИЛ-2): продукция бактериальными системами
IL-2 экспрессировали в E. coli практически сразу после клонирования его кДНК [ Devos, ea, 1983 ]. Для экспрессии IL-2 авторы использовали trp промотор или промотор фага p., которые вместе с участками связывания рибосом и ATG- кодоном встраивали перед последовательностью кДНК IL-2, кодирующей зрелый белок. После трансформации полученными конструкциями клеток E. coli выход биологически активного IL-2 составил 5-10% от общего клеточного белка.
До настоящего времени нет общей теории, позволяющей предсказать уровень экспрессии того или иного гена по его первичной структуре или структуре регуляторных областей. Очевидно, еще недостаточно полно исследованы все факторы, влияющие на экспрессию. Поэтому задачу создания вектора для экспрессии белка обычно решают эмпирически.
В большинстве последующих работ использовался триптофановый оперон E. coli, включающий *trp промотор, оператор и последовательность Шайна-Дальгарно [ Mcgrogan,M, ea, 1984 , Kashima,N., H.Matsui, ea, 1987 , van Kimmenade A., ea, 1989 , Debabov, ea, 1987 , Sato,T., H.Matsui, ea, 1987 , Marquis D.M., ea, 1986 ]. Лучшие из полученных продуцентов экспрессировали IL-2 в количестве 20-30% от общего клеточного белка, что составляет около 10 ед. биологической активности на мл бактериальной культуры.
Такой высокий уровень синтеза был достигнут после изучения некоторых критических моментов, от которых зависит эффективность экспрессии эукариотических белков в E. coli. Так, после включения в состав рекомбинантной плазмиды терминаторов транскрипции trpA и lpp , уровень синтеза возрос в 2-5 раз.[ Sato,T., H.Matsui, ea, 1987 ]. Делеция части 3'-некодирующей области кДНК IL-2 (AT- и GC-концов) привела к увеличению экспрессии IL-2 на 1-2 порядка [ Sato,T., H.Matsui, ea, 1987 ]. При размещении на расстоянии 5-9 нуклеотидов от ATG кодона синтетической последовательности Шайна-Дальгарно эффективность экспрессии достигла 20% от общего клеточного белка [ Marquis D.M., ea, 1986 ].
Для повышения продукции IL-2 была синтезирована последовательность кДНК IL-2, в которой использовались кодоны с максимальной частотой встречаемости в E. coli [ Williams,D.P., ea, 1988 ]. Увеличение процента преимущественных кодонов с 43% в нативной кДНК последовательности до 85% в синтетической последовательности привело к повышению уровня синтеза рекомбинантного (rIL-2) в 16 раз. Для получения IL-2 кроме бактериальных систем применялись и актиномицеты ( Streptomyces lividans ) [ Munoz A., Perez-Arando A., ea, 1985 ]. Однако, уровень экспрессии (около 200 ед/мл IL-2) был явно недостаточен для биотехнологического производства.
Смотрите также:
