Лактоферрин: связывание с ДНК
О способности ЛФ эффективно связывать нуклеиновые кислоты известно уже около 20 лет [ Bennet, ea 1982 ], однако, какую именно роль играет подобный тип взаимодействий в контексте биологической роли белка, до сих пор неясно. Беннет и соавторы [ Bennet, ea 1983 ] (см. выше) предполагали, что взаимодействиям ЛФ- ДНК отводится основная роль в процессах взаимодействия белка с некоторыми клетками, и рассматривали ДНК клеточных мембран в качестве основного кандидата на роль универсального рецептора ЛФ. Хотя важность взаимодействий ЛФ с ДНК неоднократно отмечалась многими исследователями, количественные характеристики этого процесса вплоть до недавнего времени не были описаны. Недавно Хе и Фурманским [ He, ea 1995 ] было установлено, что связывание белка с ДНК может иметь специфический характер. Они установили три специфические последовательности ДНК, к которым белок проявляет повышенное сродство: GGCACTT(G/A)C (ON1) , TAGA(A/G)GATCAAA (ON2) и ACTACAGTCTACA (ON3) . Авторы определили величину Kd, характеризующую комплексообразование ЛФ с фрагментом ДНК длиной 255 пар нуклеотидов, содержащим последовательность ON 1 (1,24 нМ), и стехиометрию связывания - 2 моля ДНК на 1 моль ЛФ при низких концентрациях белка и 4 моля ДНК на 1 моль ЛФ при высоких концентрациях белка. Недавно нами было обнаружено, что молекула ЛФ содержит два центра связывания нуклеиновых кислот с различным сродством к ним [ Kanyshkova, ea 1999 ]. Анализ данных по задержке в геле комплексов ЛФ со специфическими и неспецифическими олигонуклеотидами длиной 10-13 звеньев показал, что сродство первого и второго центров (Кd1/Кd2) для специфической последовательности (олигонуклеотид ON2) различается в ~ 1200 раз, тогда как для нескольких неспецифических олигонуклеотидов - в 30-56 раз. Такое большое изменение разницы в сродстве олигонуклеотидов к первому и второму центрам белка при переходе от неспецифической к специфической последовательности может свидетельствовать об отрицательной кооперативности при связывании нуклеиновых кислот со специфическими последовательностями. О существенных изменениях конформации белка при образовании комплекса с олигонуклеотидами свидетельствовало также изменение собственной флуоресценции ЛФ. Оценка сродства различных центров ЛФ к специфическим и неспецифическим олигонуклеотидам с помощью флуоресцентного титрования и гель-ретардации привела к одинаковым результатам [ Kanyshkova, ea 1999 ]. Показано, что оба центра, узнающие нуклеиновые кислоты, расположены в N-концевой части молекулы лактоферрина и, если они и не совпадают, то в значительной степени перекрываются с ранее описанными полианионсвязывающими сайтами [ Mann, ea 1994 , Kanyshkova, ea 1999 ]. Согласно нашим данным, на активность ЛФ по отношению к нуклеиновым кислотам существенное влияние могут оказывать различные ионы одно и двухвалентных металлов (К+, Na+, Mg2+, Mn2+, Са2+, Zn2+, Gu2+) при концентрациях порядка 1-5 мМ. Пока неясно, связываются ли ионы этих металлов в том же центре ЛФ, что и ионы Fe3+ (Kd = I нМ). Однако очевидно, что комплексообразование белка с этими металлами также может изменять его лигандсвязывающие свойства. Кроме того, согласно нашим данным, комплексообразование ЛФ с ДНК не является быстрым процессом, как в случае большого числа известных ДНК- и РНК-зависимых ферментов репликации, репарации, транскрипции, топоизомеризации и т. д. [ Невинский ea 1995 , Бугреев ea 1999 ], а требует предынкубации смесей белка с нуклеиновыми кислотами. Некоторые низкомолекулярные лиганды типа АТР и NAD могут существенным образом влиять на этот процесс [ Semenov, ea 1999 ]. Для понимания возможных причин такого поведения ЛФ следует проанализировать литературные данные об олигомерных формах белка .
Смотрите также:
