Микоплазмы: методы выявления: авторадиографический
Применение авторадиографического метода основано на том, что клетки, контаминированные микоплазмами, в значительной мере утрачивают способность включать тимидин в ядра. Это объясняется действием специфического микоплазменного фермента пиримидин- нуклеозидфосфорилазы, превращающего тимидин в тимин, а также способностью микоплазм активно включать тимин, в то время как клетки млекопитающих тимин практически не включают ( Levine, 1974 ; Kapratova et al., 1981 ).
Клетки, проверяемые на наличие микоплазменной инфекции, выращивают на покровных стеклах с 'Н-тимидином в течение нескольких часов, фиксируют, окрашивают, подсушивают, покрывают фотоэмульсией и экспонируют от 1 до 45 сут, затем проявляют и просматривают в световом микроскопе. В случае контаминации клеток микоплазмами черные зерна восстановленного серебра располагаются преимущественно над цитоплазмой или вне клеток, а не над ядрами. Продолжительность экспозиции и качество автографов зависят от качества фотоэмульсии и удельной радиоактивности 3H-тимидина. В среднем экспозиция занимает не менее недели.
Активность микоплазменной пиримидин-нуклеозидфосфорилазы в сочетании с 3H-тимидином может быть использована не только в авторадиографии. В качестве примера приведем опыт выявления микоплазм с помощью индикаторной линии лимфоцитов мыши (CTLL). Культуральная среда клеток, контаминированных микоплазмами, в тысячи раз понижает способность клеток CTLL включать 3H-тимидин в ДНК. При этом возможна количественная оценка контаминации, так как радиоактивность кислотонерастворимой фракции индикаторных клеток оказывается обратно пропорциональной степени контаминации тестируемых клеток ( Sinigaglia et al., 1985 ).
Однако не все микоплазмы включают свободные основания и нуклеозиды Например, Acholeplasma laidlawii , Mycoplasma arginini и M. hyorhinis включают аденин, урацил, гуанин, но не цитозин и не тимин, а микоплазмы, не ферментирующие глюкозу, вообще не способны включать нукдеозиды. Это обстоятельство понижает ценность авторадиографического метода.
Смотрите также:
