Микоплазмы: методы выявления: молекулярная гибридизация
Группа методов молекулярной гибридизации, применяемая для выявления и идентификации микоплазменных заражений, основана на комплементарности цепей нуклеиновых кислот, способных образовывать стабильные двуспиральные комплексы. Осутствие заметной гомологии (гибридизуемости) между ДНК многих микоплазм было отмечено еще в работах конца 60-х годов (см. обзор: Neimark, 1970 ). На основании этих результатов начали использовать в качестве гибридизационных зондов для обнаружения и идентификации микоплазм тотальные препараты меченой ДНК, полученные из биомассы микоплазм. Такие зонды оказались высокоэффективными и достаточно специфичными, но их нельзя рекомендовать для широкого применения, так как получение чистых культур микоплазм и их выращивание в препаративных количествах связаны со значительными техническими трудностями. При перекрестной блот-гибридизации ДНК разных видов микоплазм было показано, что гетеродуплексы образуют лишь отдельные протяженные фрагменты геномов, а не короткие участки, распределенные по всей длине ДНК.
В связи с этим предприняли клонирование случайных рестриктазных фрагментов ДНК микоплазм в плазмиде pBR322 и проверку рекомбинантных плазмид на специфичность в опытах по блот- и дот-гибридизации с ДНК различных микоплазм и ДНК клеток эукариот. Был составлен комплект плазмидзондов, содержащих фрагменты ДНК, видоспецифичные для каждой из взятых микоплазм. Кроме того, был сконструирован зонд на основе фрагмента одного из рибосомных оперонов микоплазмы. Вследствие консерватизма рибосомных генов прокариот такой зонд является универсальным и пригоден для обнаружения широкого спектра микоплазменных и бактериальных заражений клеток человека или животных в культуре. Однако универсальный зонд непригоден для идентификации вида контаминанта.
Чувствительность этого метода при использовании зондов, меченных 32Р в реакции никтрансляции, с последующей радиоавтографией составляет около 1 нг микоплазменной ДНК, что соответствует примерно 10^6 клеток микоплазмы ( Чернова и др., 1986 ; Борхсениус и др., 1987 ).
Плазмидные зонды для выявления микоплазменных контаминации клеточных культур были почти одновременно сконструированы в нескольких лабораториях и быстро распространились среди исследователей ( Gobel, Stanbridge, 1984 ; Моuches et al., 1984 ; Taylor et al., 1984 ; McGarrity, Kotani, 1986 ; Razin et al., 1986 ).
Увеличение чувствительности метода было достигнуто благодаря ДНК- РНК-гибридизации с ДНК-зондами, комплементарными микоплазменным рибосомным РНК, так как молекулы рРНК представлены в клетках микоплазм большим (около 10000) количеством копий. Фирмой "Gen-Probe" предложен диагностический набор реагентов, включающий 3H-меченые одноцепочечные фрагменты ДНК, гомологичные последовательностям 16S и 23S рРНК микоплазм. Этот метод предполагает вскрытие клеток детергентом, отжиг с РНК исследуемой пробы в растворе, отделение фрагментов 3H-ДНК, не образовавших дуплексы с РНК микоплазм, и измерение количества радиоактивного материала в сцинтилляционном счетчике.
Данный способ позволяет выявлять 10^3 - 10^4 микоплазм в тестируемом образце ( Калачиков и др., 1994 ; Fleckenstein et al., 1994 ). Такой уровень чувствительности достаточен для выявления микоплазменной инфекции у высших организмов, но недостаточен для тестирования клеточных культур на микоплазмы, когда нельзя пропустить даже единственную микоплазменную частицу.
Смотрите также:
