Микоплазмы: методы выявления: серологические
Видовая и штаммовая специфичность микоплазм, контаминирующих клеточные культуры, первоначально определялась серологическими методами с использованием реакции ингибирования роста микоплазм на поверхности твердого агара или в толще полужидкого агара (см. обзор: Clyde, 1983 ), реакции ингибирования метаболизма микоплазм в бульонной культуре и двойной диффузии, иммуноэлектрофореза в гелях ( Кеnnу, 1983 ) и реакции связывания комплемента ( Brunner, 1983 ), реакции агрегат-гемагглютинации с использованием эритроцитов, а также иммунофлуоресценции микоплазм на поверхности клеток и иммунофлуоресценции колоний на поверхности агара ( Kotany, McGarrity, 1985 ).
Наиболее удачными из "серологической" группы оказались приемы, основанные на фиксации антигена, т. е. культуральной среды и клеток, проверяемых на присутствие микоплазм. Позднее иммунные сыворотки заменили очищенными препаратами поликлональных антител и моноклональными антителами. Фиксацию антигена чаще всего проводят на нитроцеллюлозном фильтре с последующим его выявлением в реакциях с мечеными антителами. При этом используются радиоактивные, ферментные или флуоресцентные метки. Повышение чувствительности метода может быть достигнуто при нанесении проб на нитроцеллюлозный фильтр с использованием микроворонок, что позволяет значительно увеличить объем исследуемого материала ( Gabridge et al., 1986 ). Используют поликлональные (например, кроличьи) и моноклональные антитела, полученные против поверхностных антигенов микоплазм разных видов.
Для тестирования культуральную среду от зараженных клеток наносят на нитроцеллюлозный фильтр, затем инкубируют со специфическими антителами в растворе, блокируют неспецифическое связывание и после промывки вновь инкубируют с вторичными, антикроличьими или антимышиными антителами, меченными пероксидазой. Для увеличения чувствительности антитела можно пометить биотином, что позволяет увеличить интенсивность метки за счет биотин-авидиновых комплексов. Моноклональные антитела к поверхностным антигенам микоплазм не должны давать перекрестных реакций с другими видами микоплазм. Чувствительность этого метода обычно составляет 10^3- 10^5 микоплазменных частиц.
Смотрите также:
