МИТОХОНДРИИ ДРОЖЖЕЙ: СУБФРАКЦИОНИРОВАНИЕ
Описано несколько методов разделения внешней и внутренней мембраны и растворимых компонентов митохондрий [см. Лузиков ea 1980 , Lloyd ea 1974 , Tzagoloff ea 1982 ]. Они основаны на фрагментации внешней мембраны путем индукции осмотического набухания митохондрий или избирательного разрушения внешней мембраны низкими концентрациями дигитонина с последующим разделением мембран центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Первые препараты внешней и внутренней мембран митохондрий дрожжей [ Ассосеbеrrу ea 1972 , Bandlow ea 1972 , Bednasz-Prashad ea 1987 ] и Neurospora crassa [ Cassady ea 1969 , Neupert ea 1971 ] были получены процедурой, включающей набухание митохондрий в гипотонической среде, сокращение внутренней мембраны добавлением АТР или высоких концентраций осмотических стабилизаторов, отделение внешней мембраны мягкой обработкой ультразвуком или гомогенизированием и разделение везикул мембран дифференциальным центрифугированием и (или) центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Принципиально та же схема фракционирования была использована и в дальнейшем для выделения высокоочищенных препаратов внешней мембраны [ Enosawa ea 1986 , Gasser ea 1982 , Gasser ea 1983 , Lakin-Thomas ea 1985 , Lakin-Thomas ea 1988 ]. Иной способ ступенчатой фрагментации митохондрий был использован в работе [ Velours ea 1977 ]. Авторами найдено, что растительный стероид дигитонин , обладающий поверхностно-активными свойствами, в низких концентрациях (-1 мг на 1 мг митохондриального белка) способен избирательно взаимодействовать с внешней мембраной дрожжевых митохондрий, разрушая ее, оставляя при этом осмотически интактными митоцисты (внутренняя мембрана и содержимое матрикса). В более высоких концентрациях дигитонин разрушал и внутреннюю мембрану. Метод дезынтеграции дрожжевых клеток с помощью дигитонина не получил, однако, широкого распространения, так как в лаборатории G. Schatz [ Itotim ea 1982 ] было показано, что при всех использованных концентрациях дигитонина, даже самых низких, происходит выход матриксиых ферментов, т. е. имеет место нарушение интактности внутренней митохондриальной мембраны. Авторами был предложен метод контролируемого осмотического шока сферопластов в присутствии бычьего сывороточного альбумина и ингибитора протеиназ для выделения не только фракций внешней и внутренней митохондриальных мембран, но и двух других компартментов - межмембранного пространства и матрикса ( рис. 9 ). В дальнейшем этот метод был использован в этой и других лабораториях для установления внутримитохондриальной локализации ферментов и выяснения механизмов транслокации белков, синтезируемых в виде предшественников на цитоплазматических рибосомах и затем транспортируемых в митохондрии. В последнее время, главным образом в связи с проблемой биогенеза митохондрий, внимание исследователей привлечено к так называемым " контактным точкам " - местам плотного прилегания внешней и внутренней митохондриальных мембран ( рис. 10 ). Впервые образование [ Brdiczka ea 1990 ] контактов между внешней и внутренней митохондриальными мембранами наблюдали [ Hackenbrock ea 1968 ] на ультратонких срезах митохондрий печени и предположили, что они могут играть определенную роль в сопряжении активности креатинкиназы , локализованной в межмембранном пространстве , и ADP/ATP переносчиком , локализованным во внутренней митохондриальной мембране . В настоящее время не только получены доказательства правильности этого исходного предположения, но и выявлены дополнительные функции, осуществляемые контактными точками (см. ниже). При фракционировании митохондрий контактные точки выделяют в виде стабильных структур [см. Schwaiger ea 1987 ] с плавучей плотностью, отличной от плавучей плотности как внешней, так и внутренней мембраны. Контактные точки, по мнению многих исследователей, образуют пятый компартмент митохондрий.
Смотрите также:
