ОПЭ (обратный перенос электронов): роль восстановительных эквивалентов


В своем подходе к проблеме мы исходили из того, что в обеспечении энергозависимого транспорта электронов наиболее эффективны те субстраты, которые являются основными поставщиками восстановительных эквивалентов в дыхательную цепь. В митохондриях большинства животных тканей именно таким субстратом является сукцинат [см. Кондрашова и др 1972 ]. В митохондриях дрожжей, как нами было установлено [ Звигельская и др 1983 , Звигельская и др 1981а , Звигельская и др 1977а , Звигельская и др 1974 , Зеленщикова и др 1982 , Котельникова и др 1984 ], основной источник восстановительных эквивалентов может быть отличен от сукцината, его природа определяется конкретным характером обмена, особенностями цитозоль-митохондриальных взаимоотношений.

Мы предположили, что неудачи в демонстрации ОПЭ за счет энергии окисления сукцината в митохондриях из клеток дрожжей, выращенных на сбраживаемых субстратах и глицерине, связаны с тем, что в этих условиях основным источником восстановительных эквивалентов является не сукцинат, а другие субстраты: при выращивании на сахарозе (глюкозе) - экзогенный NADH [ Звигельская и др 1980 , Звигельская и др 1977а , Звигельская и др 1974 , Котельникова и др 1984 ], на глицерине - экзогенный NADH и а-глицерофосфат [ Звигельская и др 1981а , Котельникова и др 1984 ]. В соответствии с предложенной концепцией именно эти субстраты должны быть наиболее эффективными индукторами ОПЭ. Для проверки правильности предположения при исследовании ОПЭ наряду со стандартным флуорометрическим методом был использован метод низкотемпературной ЭПР-спектроскопии, позволяющий следить за степенью восстановленности железосерных центров NADH-дегидрогеназного комплекса дыхательной цепи. Эта работа была проведена совместно с Д. Ш. Бурбаевым и В. А. Зеленщиковой. Об обратном переносе электронов при добавлении флавинозависимых субстратов судили по восстановлению железо-серных центров N-Ib (по изменению формы и ширины сигнала при g= 1,92-1,94 (Т=20 К) и увеличению интенсивности минимума при g=l,93 (T=40 К), и низкопотенциальной формы N-2 (по увеличению интенсивности g-компоненты, g-1,92), расположенных по субстратную сторону от 1 пункта сопряжения . Полное восстановление железосерных центров NADH-дегидрогеназного комплекса достигалось добавлением NAD- зависимых субстратов пирувата+малата в присутствии ротенона . Для митохондрий из клеток, выращенных на сахарозе, найдено [ Звигельская и др 1983в ], что инкубация с экзогенным NADH ( рис. 35а ) в течение 15с приводила к такому же полному восстановлению ЖСЦ N-Ib и N-2 , как и инкубация с NAD- зависимыми субстратами ( рис. 35б ) в течение 2-х минут. В контрольном эксперименте ( рис. 35д ) показано, что окисление митохондриями экзогенного NADH в присутствии ингибитора транспорта электронов - KCN даже в течение 3 мин вызывало восстановление лишь высокопотенциальной формы ЖСЦ N-2 (амплитуда сигнала при g-1,92 (Т=22К) в два раза меньше) (ср. с рис. 35а ). Это указывало на непроницаемость внутренней митохондриальной мембраны для экзогенного NADH, а также на энергозависимый характер восстановления N-Ib и низкопотенциальной формы N-2. При инкубации митохондрий с а-глицерофосфатом в течение 40 с наблюдалось восстановление ЖСЦ N-2 (обеих форм) и S-1 ( рис. 35г ), при более длительной инкубации восстанавливался также центр N-Ib. Окисление митохондриями сукцината в течение 3 мин приводило к восстановлению обеих форм - N-2 и S-1, но не N-lb ( рис. 35в ), т. е. a-глицерофосфат был менее эффективен в индукции энергозависимого ОПЭ, чем экзогенный НАДН, а сукцинат вообще был мало активен в поддержании этой реакции.

Аналогичные данные получены флуорометрическим методом. Характерно, что сукцинат даже в присутствии АТФ-регенерирующей системы, активирующей сукцинатдегидрогеназу, вызывал меньшее восстановление митохондриального пула НАД, чем а-глицерофосфат.

Таким образом, в соответствии с теоретическими предпосылками, впервые была показана возможность обратного транспорта электронов в митохондриях дрожжей аэробного типа при окислении экзогенного NADH [ Звигельская и др 1982а ], более того, при этом скорость и степень восстановления железосерных центров NADH-дегидрогеназного комплекса были значительно выше, чем при окислении сукцината. Следует заметить, что такого рода исследования требовали высокой степени интактности митохондриальных структур. Как уже отмечалось, инкубация митохондрий с NADH в присутствии KCN приводила лишь к восстановлению высокопотенциальной формы N-2, что свидетельствовало о непроницаемости внутренней митохондриальной мембраны для экзогенного NADH. В противном случае постановка такого рода экспериментов была бы неправомерной.

Концепция о преимущественном поддержании ОПЭ основными источниками восстановительных эквивалентов получила дополнительное подтверждение при анализе других моделей. Было найдено, что при выращивании дрожжей Е. rnagnusii на глицерине, где основными источниками восстановительных эквивалентов был экзогенный NADH и а-глидерофосфат [ Звигельская и др 1981а , Котельникова и др 1984 ], именно эти субстраты вызывали полное восстановление HADH-дегидрогеназного комплекса дыхательной цепи ( рис. 36 ), причем экзогенный HADH за 15 с, а- глицерофосфат - за 2 мин [ Звигельская и др 1981 , Зеленщикова и др 1983 ]. Сукцинат не был активен в этом процессе. При выращивании дрожжей на DL-лактате или ацетате, когда имела место активация глиоксалатного цикла (нами была обнаружена 10-25-кратная активация изоцитратлиазы - ключевого фермента цикла) и образование сукцината в цитоплазме, анализ окислительной активности митохондрий тотчас фиксировал увеличение активности сукцинатдегидрогеназы (сукцинат, по определению, становился одним из основных источников восстановительных эквивалентов) [ Зеленщикова и др 1982 ], а методы флуорометрии и низкотемпературной ЭПР-спектроскопии - способность этого субстрата индуцировать восстановление митохондриального NAD(P). Однако и в этих моделях экзогенный NADH оставался наиболее быстро утилизируемым субстратом и наиболее мощным индуктором ОПЭ [ Звигельская и др 1983 , Зеленщикова и др 1982 , Котельникова и др 1984 ]. По-видимому, эффективность этого механизма настолько высока, что он сохраняется и в тех случаях, когда непосредственная утилизация субстрата в цитоплазме не сопровождается образованием значительных количеств NAD(P)H и для поддержания этого механизма необходим выход восстановительных эквивалентов из митохондрий в цитоплазму (по нашим данным, в виде изоцитрата (цитрата), а также, возможно, малата) [ Звигельская и др 1983 , Зеленщикова и др 1982 ]. Различная эффективность флавинзависимых субстратов в поддержании обратного переноса электронов побудила нас исследовать вопрос о причинах этого явления и возможных способах его регуляции. Полученные данные позволили исключить термодинамический потенциал в качестве фактора, регулирующего эффективность субстрата в поддержании ОПЭ: окислительно- восстановительный потенциал пар NADH/NAD и NADPH/NADP близок, но экзогенный NADPH, окислявшийся с относительно низкой скоростью, не индуцировал ОПЭ, точно также а-глицерофосфат был менее эффективен, чем сукцинат в индукции ОПЭ при выращивании клеток дрожжей на лактате и ацетате. Отсутствие существенных различий в величинах мембранного потенциала ( Ai/> ), генерируемого при окислении всех исследованных флавинзависимых субстратов (сукцината, а-глицерофосфата, экзогенных NADH и NADPH) [ Звигельская и др 1983 ] не дал оснований рассматривать и величину мембранного потенциала (при значениях более 200 мВ) в качестве фактора, контролирующего интенсивность ОПЭ.

С другой стороны, мы обратили внимание на четкую корреляцию между степенью восстановления ЖСЦ и скоростью окисления митохондриями данного субстрата, отражающую эффективность поставки электронов в дыхательную цепь. Мы предположили, что интенсивность ОПЭ зависит от степени восстановленности переносчиков, поставляющих электроны в цепь обратного переноса (по-видимому, пула коэнзима Q ). Для доказательства этого предположения в митохондриях из клеток Е. magnusii, выращенных на глицерине, исследовали интенсивность восстановления ЖСЦ N-Ib и N-2 при частичном ингибировании низкими концентрациями цианида скорости окисления экзогенного NADH и а- глицерофосфата до уровня, соответствующего скорости окисления сукцината. Альтернативный путь окисления блокировали добавлением салицилгидроксамата (СГ) , в этих условиях эффективность процесса окислительного фосфорилирования при окислении флавинзависимых субстратов близка. В соответствии с высказанным предположением было найдено, что интенсивность ОПЭ коррелировала со скоростью поступления восстановительных эквивалентов в дыхательную цепь ( рис. 37 ) [ Звигельская и др 1983 , Котельникова и др 1984 ], которая отражала, вероятно, степень восстановленности переносчиков, поставляющих электроны в цепь ОПЭ (по-видимому, соответствующего пула Q). Полученные данные позволили не только понять, почему в митохондриях дрожжей аэробного типа, выращенных на сбраживаемых субстратах и глицерине, не был продемонстрирован обратный перенос электронов при окислении сукцината (реакция, легко воспроизводимая на митохондриях из животных тканей), но и предсказать на основании анализа окислительных активностей митохондрий, какой из субстратов будет наиболее эффективен в индукции обратного переноса электронов. Это, вероятно, справедливо не только для дрожжей. Предложена гипотеза, рассматривающая альтернативный окислительный путь в качестве одного из факторов, могущих регулировать интенсивность ОПЭ в дыхательной цепи дрожжей.

Расширение концепции об основных источниках восстановительных эквивалентов позволило нам продемонстрировать впервые для дрожжевых митохондрий обратный перенос электронов за счет энергии гидролиза АТР [ Звигельская и др 1982 ]. В качестве источника энергии использовали АТР-регенерирующую систему, а модели - дрожжи Е. magnusii, выращенные на сахарозе в присутствии антимицина А, у которых окисление флавинзависимых субстратов осуществлялось по альтернативному нефосфорилирующему пути [ Звигельская и др 1977 ]. Восстановление эндогенного пула пиридиновых нуклеотидов за счет энергии гидролиза АТР могло быть единственным способом регуляции их редокс-состояния. В предварительных опытах было показано, что такие митохондрии содержали те же железосерные центры, что и митохондрии нормального варианта [ Бурбаев 1981 , Бурбаев 1981а ]. В отличие от ранее проанализированных моделей, NADH ( рис. 38б ) как и сукцинат ( рис. 38в ) и а-глицерофосфат, вызывал восстановление только высокопотенциальной формы N-2. Лишь в присутствии АТР-регенерирующей системы можно было наблюдать восстановление железосерного центра N-lb и низкопотенциальной формы N-2 ( рис. 38 г, е ), которое предотвращалось или в значительной мере уменьшалось добавлением олигомицина ( рис. 38 д, ж ). Аналогичные данные были получены и флуорометрическим методом.

Смотрите также:

  • ОПЭ (обратный перенос электронов в дыхательной цепи)