CMC (Chemical Mismatch Cleavage)
CMC (Chemical Mismatch Cleavage) - метод химического расщепления некомплементарных сайтов - основан на способности некоторых химических агентов специфически разрывать нить ДНК в месте локализации неспаренного основания ( рис 4-7 ). Так, цитозин чувствителен к действию гидроксиламина , а тимин - к действию осмия тетраоксида . Некоторые модификации метода используют чувствительность тимина и гуанина к карбодиимиду . Последующая обработка пиперидином приводит к полному разрыву молекулы ДНК в модифицированном сайте. Выявление мутаций осуществляют с помощью меченых ДНК-зондов, соответствующих, как правило, нормальным вариантам последовательности ДНК. Такими зондами могут быть синтезированные олигонуклеотиды, клонированные последовательности ДНК или ее амплифицированные фрагменты [ Cotton R.G.H., 1990 ; Cotton R.G.H., Malcolm A.D.B., 1991 ].
При проведении исследования эталонную меченую ДНК смешивают с избытком тестируемой ДНК (или РНК). Тестируемыми образцами ДНК могут служить клонированные ДНК, обработанные соответствующими эндонуклеазами, либо амплифицированные фрагменты. Смесь нагревают до полной денатурации двухнитевых молекул и затем охлаждают, чтобы создать условия для образования дуплексов. При наличии мутаций в тестируемых образцах ДНК в гетеродуплексах, возникших в результате гибридизации между однонитевыми молекулами эталонной и тестируемой ДНК, образуются места негомологичного спаривания. После обработки соответствующими химическими агентами идентификация и локализация мутантных сайтов в исследуемых участках ДНК проводится путем электрофореза и радиоавтографии. Появление укороченных фрагментов ДНК на электрофореграмме (а точнее - необычных бэндов в нижней части геля) свидетельствует о наличии мутантного сайта, а определение размера укороченных фрагментов однозначно определяет локализацию этого сайга в исходной тестируемой молекуле ДНК.
Модификации метода CMC позволяют идентифицировать до 95-100% мутаций [ Grompe M., 1993 ].
Преимуществами метода являются: возможность исследовать протяженные участки ДНК - до 2 тыс. п.о.; способность одновременно выявить и локализовать несколько мутаций в одном фрагменте ДНК; возможность одновременно использовать несколько ДНК-зондов для поиска мутаций - мультиплексный вариант методики.
К недостаткам можно отнести высокую токсичность используемых химических реактивов, которая может быть ослаблена использованием карбодиимида для идентификации GT- гетеродуплексов.
Смотрите также:
