Тирозинемия I типа: генотерапия
В последние годы развивается генной терапия наследственных дефектов человека. В 1995 году была опубликована работа по переносу гена фумарилацетоацетат гидролазы человека в фибробласты больных тирозинемией I типа. Сконструированная ретровирусная плазмида pHFAH HA2 ( Phaneuf D.,1991 ) была расщеплена рестриктазой Stu l и удаленный фрагмента в 45 bp, содержащий канонический поли-A конец, был заменен Bgl II линкером. Кодирующая последовательность кДНК FAH, вырезанная рестриктазами Bam HI и Bgl II, была субклонирована в плазмиду pLXSN . В сконструированном векторе (pLFAHSN) кДНК FAH транскрибируется под контролем 5' длинных концевых повторов (LTR). Плазмида содержит "neo" кассету с промотором SV 40, кодирующую неомицин фосфотрансферазу. Такая конструкция позволяла проводить селекцию клеток, резистентных к аналогу неомицина G418. Первичные фибробласты, полученные биопсией кожи от больных тирозинемией I типа, были инфицированы рекомбинантной ретровирусной плазмидой. В трансформированных фибробластах присутствие FAH протеина регистрировалось с помощью Western блоттинга и анти-FAH антител. Активность FAH была повышена в 25-30 раз по сравнению с нетрансформированными фибробластами. Экспрессия FAH регистрировалась в течение 6 месяцев.
Ретровирусные векторы широко используются в протоколах генной терапии, т.к. стабильно интегрируемый трансген эффективно экспрессируется в реципиентных клетках.
В 1996 году в модельных опытах на мышах продемонстрировано эффективное применение генной терапии на печени, которое может быть использовано и в отношении больных тизинемией I типа. В гепатоциты FAH(-) мышей был трансдуцирован ген FAH путем ретровирусной инфекции. Отобранные рекомбинатные FAH(+) гепатоциты были инъецированы в печень мышей с тирозинемий. Как показали исследования, у данных мышей полностью восстанавливалась FAH активность в печени ( Overturf K.,1996 ).
Смотрите также:
