Эритропоэтин: выделение с применением методов генной инженерии
Во всех случаях получение эритропоэтина ограничивается трудностями, связанными с выделением и культивированием клеток, нестабильностью продукции гормона и, наконец, низкой концентрацией его в культуральных жидкостях.
Принципиально иной подход к получению больших количеств высоко очищенного эритропоэтина был связан с применением методов генной и клеточной инженерии. Была сделана попытка создания бактериального продуцента эритропоэтина ( Lee-Huang S., 1984 ). Продуцируемый в Escherichia coli белок узнается антителами против эритропоэтина и имеет молекулярную массу, примерно соответствующую дегликозилированному эритропоэтину человека. Известно, что бактериальные клетки имеют систему гликозилирования, принципиально отличающуюся от эукариотической. Поэтому получить корректно гликозилированный белок в бактериальных клетках невозможно. В случае эритропоэтина получение корректно гликозилированного гликопротеида имеет принципиальное значение и, следовательно, создание продуцента гормона на основе бактериальных клеток является нецелесообразным.
Эффективный продуцент биологически активного как in vitro, так и in vivo эритропоэтина может быть получен только на основе клеток высших животных. Сделана попытка получения эритропоэтина человека на основе клеток насекомых ( Wojchowski D. et al., 1987 ). Для экспрессии гена эритропоэтина в данном случае был использован вектор на основе бакуловируса. Секретируемый клетками насекомых эритропоэтин имеет молекулярную массу намного ниже, чем нативный эритропоэтин человека, то есть корректного гликозилирования в данной системе не происходит. Полученный в этой работе эритропоэтин проявляет биологическую активность, по крайней мере, в тестах in vitro. О биологической активность и стабильности in vivo рекомбинантного эритропоэтина, продуцируемого клетками насекомых, в данной работе не сообщается.
В работе Lin F.-K. et al., 1985 впервые cообщается о получении стабильно трансфецированных клеток линии СНО (эпителио-подобные клетки из яичника китайского хомячка), продуцирующих эритропоэтин человека. В данном случае для трансфекции клеток использовали плазмиду, содержащую ген эритропоэтина человека под контролем промотора поздних генов вируса SV40. Полученные стабильные клоны секретировали эритропоэтин в концентрации примерно 18 ед./мл. Было показано, что рекомбинантный эритропоэтин, продуцируемый клетками млекопитающих, обладает биологической активностью как в тестах in vitro, так и в тестах in vivo.
Для получения высоко эффективного продуцента эритропоэтина человека в работе Powell J. et al., 1986 использовали систему амплификации интегрированных плазмид в трансфецированных клетках линии ВНК (клетки из почки хомячка). Для этого проводили ко-трансфекцию клеток двумя плазмидами, одна из которых содержала ген эритропоэтина человека под контролем вирусного промотора, а другая - ген дигидрофолатредуктазы. Амплификация интегрированных плазмид достигалась путем культивирования клеток на среде с постоянно повышающимися концентрациями метотрексата. Полученный в данной работе продуцент секретировал до 80 мг/л эритропоэтина человека.
Аналогичная работа была проведена в СССР в НПЦ медицинской биотехнологии ( Крамерова И.А. и др., 1988 , Крамерова И.А. и др., 1989 , Крамерова И.А. и др., 1989а ). Используя олигонуклеотидный зонд, было проведено клонирование гена эритропоэтина человека, созданы эффективные векторы экспрессии, получены высоко продуктивные клеточные линии, секретирующие рекомбинантынй эритропоэтин человека, и разработаны методы выделения гормона из культуральной жидкости клеток-продуцентов. Полученный препарат прошел успешные предклинические испытания и подготовлен для испытания в клинике.
Исследование механизмов взаимодействия эритропоэтина с клетками- мишенями долгое время было невозможно из-за отсутствия радиоактивно меченого эритропоэтина, сохраняющего биологическую активность ( Goldwasser E., 1981 ). Эта проблема было решена благодаря получению рекомбинантного эритропоэтина. Меченый эритропоэтин получают несколькими способами:
1) мечение тритием по углеродной части ( Krantz S., Goldwasser E., 1984 );
2) иодирование ( Sawyer S. et al., 1987 , Todokoro K. et al., 1987 );
3) включение меченных радиоактивной серой аминокислот в процессе биосинтеза рекомбинантного эритропоэтина в трансфецированных клетках ( Mufson P., Gesner T., 1987 ).
Смотрите также:
