Рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа

Карта белка рибулозобисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы

А.К.Романова

Рибулозобисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа (РБФКО, 3-фосфо-D- глицераткарбоксилаза, КФ 4.1.1.39; ribulosebisphosphate carboxyla- seoxygenase, RubisCO, ранее: карбоксидисмутаза, рибулозодифосфат- карбоксилаза) - ключевой фермент восстановительного пентозофосфат- ного цикла ассимиляции углерода при автотрофии. Фермент, по крайней мере, на 80% ответственен за синтез органического вещества в при- родных условиях. Открыт в 1954 г. в клетках хлореллы и в листьях шпината одновременно в лабораториях М.Кэлвина и Б.Хореккера. Это явилось завершающим этапом при создании концепции ассимиляции и восстановления углерода, за что руководителю работ М.Кэлвину была присуждена Нобелевская премия. РБФКО бифункциональна и может ката- лизировать две различные по механизму реакции' карбоксилирование и оксигенирование (окисление молекулярным кислородом) одного и того же субстрата'

РБФ + СО = 2ФГК (карбоксилирование)

РБФ + О = 2-фосфогликолат + ФГК (оксигенирование), где РБФ - D-рибозо-1,5-бисфосфат; ФГК - 3-фосфоглицериновая кислота.

Вероятные механизмы реакций изображены на рис. 1.103 и 1.104.

РБФКО обнаружена в фотосинтезирующих клетках всех наземных и водных эукариотных фототрофов и прокариот' цианобактерий, у подав- ляющего большинства пурпурных и зеленых бактерий и бесхлорофильных хемолитоавтотрофных бактерий. К единичным исключениям относятся об- лигатно анаэробные зеленая бактерия Chlorobium limicola и метан- образующие хемолитоавтотрофные архебактерии.

У высших растений с классическим циклом Кэлвина (С -фотосинтез) РБФКО локализована исключительно в хлоропластах мезофилла, так же как и у растений со специфическим "крассуляциевым" обменом органи- ческих кислот (САМ-фотосинтез). При С -фотосинтезе РБФКО обнаруже- на исключительно в хлоропластах клеток обкладки сосудистых пучков, а в растениях промежуточного С -С типа в хлоропластах тканей обоих типов (мезофилла и обкладки). Большинство исследователей полагают, что у высших растений фермент локализован в строме хлоропластов, что, в частности, подтверждают результаты иммуногистохимического изучения. В некоторых случаях в условиях водного стресса наблюда- лась кристаллизация РБФКО непосредственно в строме хлоропластов. Содержание белка РБФКО в строме чрезвычайно высоко и в некоторых случаях достигает 80: или 3-4 мМ (в расчете на один активный димер фермента). Кристаллизация белка, таким образом, по крайней мере в стрессовых условиях, представляется вполне возможной, тем более, что недавно обнаружен белок, осаждающий РБФКО, синтезируемый в листьях на поздних стадиях их развития.

Высокая концентрация белка в строме является одним из аргумен- тов в пользу возможности существования ассоциатов с белками других ферментов цикла Кэлвина. В настоящее время имеются примеры выделе- ния подобных комплексов из высших растений и исследования их свойств. У эукариотных водорослей и прокариотных фото- и хемолито- автотрофов существование структурированных ассоциатов РБФКО с дру- гими белками доказано. В пиреноиде водорослей может находиться большая часть белка РБФКО, причем ей сопутствуют такие ферменты, как карбоангидраза, нитратредуктаза и некоторые другие. У цианобак- терий, нитрифицирующих, тионовых и у одного представителя водород- ных бактерий значительная часть РБФКО обнаружена в специфических паракристаллических образованиях - карбоксисомах, содержащих также и другие полипептиды. Наибольшие количества карбоксисом обнаружива- ются в культурах, переходящих в стационарную фазу роста.

Выделение РБФКО из разрушенных клеток и тканей автотрофов не встречает больших трудностей ввиду высокого содержания белка, хотя у высших растений часто требуется принятие особых мер для защиты фермента от повреждающего действия фенольных соединений. Особого внимания требует очистка РБФКО от сопутствующих белков - рибозофос- фатизомеразы и фосфорибулокиназы, которые во многих случаях состав- ляют ничтожную примесь по белку, но могут быть легко обнаружены по активности. Критериями чистоты РБФКО, кроме обычно используемых в белковой химии, является отношение поглощения А /А = 1,5 или А /А = 1,9. Значения молекулярной константы скорости для пол- ностью активированной РБФКО из различных об`ектов колеблятся от 2,5 с до 5,6 с . Белок РБФКО легко образует кристаллы при выса- ливании NaCl, (NH ) SO или при обработке полиэтиленгликолем. Кри- сталлические препараты существенно различаются по форме в зависимо- сти от условий кристаллизации.

Количественное определение содержания белка в тканях и клетках автотрофов возможно с помощью аналитического электрофореза белков экстрактов в нативной форме, дополняемого ДДС-электрофорезом, мето- дами иммунохимии, иммуноаффинной, гидрофобной хроматографии. Разра- ботан специальный метод количественного определения содержания ак- тивной формы РБФКО, основанный на получении трудно диссоциирующего комплекса (K = 10 М) с меченным С карбоксиарабинитолбисфосфа- том; известны модификации этого метода.

Наиболее распространенным методом определения карбоксилазной активности является измерение включения С в кислотоустойчивый продукт реакции после инкубации фермента с насыщающими концентра- циями субстратов: NaH CO и РБФ в присутствии ионов Mg и стаби- лизатора сульфгидрильных групп. В некоторых случаях добавляют кар- боангидразу и инертный белок (альбумин или желатин). Известны также спектрофотометрические методы определения активности РБФКО, которые однако имеют ограничения.

Определение оксигеназной активности РБФКО в большинстве случаев осуществляется путем амперометрической регистрации поглощения О в присутствии РБФ, ионов Mg или Mn и ограниченного количества СО , необходимого для поддержания фермента в активированном состоя- нии.

У всех до сих пор исследованных высших растений, водорослей, цианобактерий, занимающих особые таксономические положения Cyanidi- um caldarium и Prochroron, серных пурпурных бактерий и большинства аэробных хемолитоавтотрофов РБФКО представлена белком с молек.мас- сой 520 кДа. Ферменты этих организмов состоят из суб`единиц двух типов: восьми больших (L) и восьми малых (S) с молек. массами 50 и 12 кДа соответственно. Формула четвертичной структуры - L S . У прокариотных организмов встречаются формы с молек. массой 360 кДа, состоящие только из больших суб`единиц (L ). У Rhodospirillum кги- кгь РБФКО имеет молек. массу 120 кДа (L ).

Кардинальные успехи в расшифровке пространственной структуры РБФКО были достигнуты в результате рентгеноструктурного анализа (разрешение 2,9 и 1,9 А). Установлено, что две одинаковые суб`еди- ницы РБФКО из Rh.rubrum взаимодействуют, образуя большое число свя- зей. Каждая из суб`единиц состоит из двух доменов. Меньший, N-концевой, содержит 137 аминокислотных остатков, а больший, С- концевой, - 329 остатков. Активный центр локализован в С-концевом домене. Между доменами имеется несколько участков контакта. Ядро молекулы образовано двумя С-концевыми доменами (рис. 1.105), содер- жащими по одному иону Mg .

У ферментов, имеющих строение L S (шпинат, табак) димеры, об- разуемые большими суб`единицами, построены так же, как у Rh.rubrum. Они расположены вокруг оси симметрии четвертого порядка и образуют L -ядро молекулы. Малые суб`единицы размещаются в больших щелях, имеющихся в верхней и нижней частях ядра. Молекула РБФКО L S напо- минает цилиндр с диаметром 110 A и высотой 100 А. Все 8 активных центра находятся на наружной стороне молекулы. Малые суб`единицы удалены от активных центров и не участвуют в их образовании.

Белки РБФКО из разных источников различаются по аминокислотному составу. Большие суб`единицы, синтез которых кодируется хлоропласт- ным геномом, имеют консервативную первичную структуру, тогда как малые суб`единицы, синтез которых кодируется ядерным геномом, ха- рактеризуются значительным разнообразием. К настоящему времени пол- ностью секвенирована аминокислотная последовательность больших суб- `единиц шпината и кукурузы (рис. 1.106), гомология которых оценива- ется в 90%.

Сравнительный анализ аминокислотной последовательности N-концевого фрагмента большой суб`единицы (20 аминокислотных остат- ков) у шести представителей высших растений показал практически полную их идентичность, тогда как у эукариотной водоросли и особен- но у двух представителей цианобактерий имелось значительное число замен по сравнению с последовательностями высших растений. Уста- новлено, что консервативными остатками и фрагментами для приведен- ных на рис. 1.107 об`ектов являлись Thr-7, Gly-12 (за исключением Sp.oleracea) и тетрада Ala-Gly-Val-Lys (15-18) по нумерации для фермента шпината, принимаемой за эталон сравнения. На рис. 1.107 приведена соответствующая последовательность для РБФКО из Rh.rub- rum, не содержащая в положениях 13-19 ни одного аминокислотного остатка, общего с другими об`ектами.

Активный центр расположен в С-домене большой суб`единицы. Он имеет форму воронки, образованной участками восьми петель (рис. 1.108), которые связаны с восемью бета-"тяжами", содержащими соот- ветствующие спирали в альфа/бета-структурном домене. В области ак- тивного центра имеется большое число заряженных и полярных групп (рис. 1.109). Ион металла располагается в середине активного цент- ра, ближе к его донной части. Он образует координационные связи с аминокислотными остатками так называемого регуляторного пептида и молекулой субстрата. Одна из связей образуется с активируемой моле- кулой СО , которая взаимодействует с Lys-201. Остаток Lys-175 участвует на стадии енолизации субстрата. За отрыв протона от РБФ ответственен аминокислотный остаток с pK = 8,0.

Функции малых суб`единиц полностью не выяснены. При их удалении каталитическая активность иногда снижается на два порядка. Эти суб- `единицы, как полагают, участвуют в трех стадиях каталитического процесса и стабилизации активированного фермента. Однако они не участвуют в регуляции соотношения карбоксилирования и оксигенирова- ния и не требуются для связывания СО . Показано, что малые суб`еди- ницы РБФКО цианобактерии Anabaena имеют существенное значение для сборки холоэнзима РБФКО.

Действие РБФКО имеет гистерезисный характер. Каталитическому акту предшествует более медленная стадия активации, которая, как и каталитическая, требует присутствия СО и ионов Mg . Механизм ак- тивации состоит в том, что СО присоединяется к Lys-201 регулятор- ного пептида и образуется карбамат, после чего происходит быстрая реакция присоединения иона металла с образованием каталитически компетентного тройноого комплекса E-Lys-NH-CO -Mg . Зависимость активности полностью активированного фермента от концентрации СО выражается гиперболической функцией. Для активации РБФКО in vitro требуются концентрации СО порядка 250-500 мкМ. Значения K (CO) активированного фермента из листьев высших наземных растений колеб- лятся от 5 до 20 мкМ.

Значения K (РБФ) колеблятся от 10 до 15 мкМ, причем наблюдаемые различия не связаны с таксономическим положением организмов. Осо- бенностью кинетики РБФКО является ее нелинейность. Значения K (РБФ), определенные по начальному участку кинетической кривой (до 1 мин.), равны 15-25 мкМ. В дальнейшем скорость реакции снижается, и значения K могут достигнуть 500 мкМ. Это явление получило в лите- ратуре название "фолловер" (fallover). Полагают, что наиболее ве- роятной причиной этого является синтез ингибиторов (ксилулозо-1,5-бисфосфата и 3-кетоарабинитолфосфата), происходящий в процессе реакции карбоксилирования, а не связывание РБФ с алло- стерическим центром, как считали несколько ранее.

РБФКО представляет собой редкий пример фермента, активность которого может быть измерена in vivo, что вносит существенные кор- рективы в представления о характере действия и является стимулом для углубленных кинетических исследований in vitro. Одним из приме- ров является определение сродства к СО , которое быстро ослабевает после выделения фермента из клеток. Другой пример - развитие пред- ставления, в какой мере белок РБФКО активен в автотрофной клетке. Точка зрения конца 70-х годов о том, что лишь небольшая часть фер- мента активна in vivo, сменилась концепцией о полном активационном состоянии фермента на свету и о лимитировании фотосинтеза реакцией регенерации РБФ. В настоящее время полагают, что доля каталитически компетентного фермента зависит от освещенности. Известны два основ- ных механизма регуляции РБФКО светом' первый - ферментативная акти- вация (карбамоилирование Lys-201), катализируемая активазой, обна- руженной у всех исследованных об`ектов, и второй - обратимое связы- вание карбамоилированного фермента с ингибитором - 2- карбоксиарабинитол-1-фосфатом (КА1Ф), обнаруженное лишь у некоторых высших растений. Интересно отметить, что у мутанта Arabidopsis, не содержащего активазы, снижение активности РБФКО на свету сопровож- дается накоплением РБФ и напоминает описанный выше фолловер. Выде- ленная активаза способствует активации РБФКО шт мшекщ и препятству- ет деактивации, а также ускоряет удаление КА1Ф, связанного с актив- ным центром. Белок-белковое взаимодействие между РБФКО и активазой требует притока энергии в виде АТР и, по-видимому, участия энергии фотосинтеза на другом уровне. В целом, роль света в активации РБФКО многообразна. Она состоит в увеличении концентрации ионов Mg в строме, подщелачивании среды, синтезе АТР, и связана с еще одной, до конца не выявленной, функцией тилакоидов. Признаками этой функ- ции являются насыщение процесса активации при очень низких интен- сивностях света, неспособность дитиотреитола заменить действие све- та, ингибирование светоактивации дихлорметилмочевиной и нигерици- ном, ингибирование глиоксилатом светоактивации в выделенных хлоро- пластах. Регуляция активности РБФКО может также осуществлятся путем ковалентной модификации. Показано, что большие и малые суб`единицы РБФКО шпината и табака являются субстратами фосфорилирования. Фи- зиологическое значение фосфорилирования РБФКО не выяснено; очевид- но, оно не имеет отношения к действию активазы.

Возможности практического использования РБФКО слабо разработа- ны. Одна из них - применение высокоочищенного фермента для количе- ственного определения содержания РБФ в экстрактах из клеток авто- трофов. Вторая - использование белка РБФКО в лечебных и пищевых це- лях - привлекает еще мало внимания, хотя давно отмечено, что белок РБФКО по аминокислотному составу близок к казеину молока. Особенно привлекательной с этой точки зрения кажется возможность обогащения белка незаменимыми аминокислотами с использованием приемов генной инженерии.

Романова А.К. Биохимические методы изучения автотрофии у микро- организмов. - М.' Наука, 1980. - С. 51-56.

Lorimer G.H. The carboxylation and oxygenation of ribulose 1,5- biphosphate: The primary events in photosynthesis and photorespira- tion // Annual Rev. Plant Physiology. - 1981. - Vol. 32. - P. 349- 383.

Miziorko H.M., Lorimer G.H. Ribulose 1,5-bisphosphate carboxy- lase-oxygenase // Annual Rev. Biochem. - 1983. - Vol. 52. - P. 507- 535.

Эдвардс Дж., Уокер Д. Фотосинтез С и С растений' механизмы и регуляция. - М.' Мир, 1986. - 598 с.

Нижко В.Ф. Белки листьев' состав, строение и обмен в связи с проблемой хозяйственного использования // Физиология и биохимия культурных растений. - 1987. - Т. 19, Ъ 5. - С. 432-444.

Andersson I., Knight S., Schneider G. et al. Crystal structure of the active site of ribulose bisphosphate carboxylase // Nature. - 1989. - Vol. 337, N 6204. - P. 229-234.

Campbell W.J., Ogren W.L. A novel role for light in the activa- tion of ribulosebisphosphate carboxylase/oxygenase // Plant. Phy- siol. - 1990. - Vol. 92, N 1. - P. 110-115.

Edmondson D.L., Badger M.R., Andrews T.J. Slow inactivation of ribulose bisphosphate carboxylase during catalysis is not due to decarbamylation of the catalytic site // Plant Physiol. - 1990. - Vol. 93, N 4. - P. 1383-1389.

Романова А.К. Рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза-оксигиназа // Успехи биологической химии. - М.' Наука, 1991. - Т. 32. - С. 87- 113.

Бабаджанова М.А., Насыров Ю.С. Мультиферментный комплекс ключе- вых ферментов фотосинтеза // Физиология растений. - 1992. - Т. 39, Ъ 4. - С. 753-759.

Jensen R.G., Zhu G. Rubisco fallover and negative cooperativity of substrate binding // Photosynthesis Res. - 1992. - Vol. 34, N 1. - P. 195.