SOS-система у E. coli
При прохождении репликативного комплекса через некодирующий или ошибочно кодирующий поврежденный участок ДНК наблюдается включение в синтезируемую цепь случайных или соответствующих мутантному участку нуклеотидов. Затем репликация ДНК продолжается в обычном режиме. Таким образом, появляются поврежденные участки ДНК.
У E. coli в ответ на повреждения ДНК происходит координированная экспрессия большого числа генов (прмерно 26 белков). Такая реакция бактериальных клеток на генотоксические воздействия получила название SOS-ответа , а процесс образования мутаций - SOS- мутагенеза. В индукции SOS-ответа у E. coli определяющую роль играют ген lexA и ген recA . Белок LexA является репрессором гена recA и более 20 других генов и оперонов, составляющих SOS-регулон . В ответ на повреждение ДНК или ингибирование репликации, при прохождении ДНК- полимеразой поврежденного участка ДНК вырабатывается SOS-сигнал.
Дерепрессия SOS-регулона происходит путем усиления авторасщепления белка LexA, стимулируемого аллостерически его взаимодействием с белком RecA . В результате дерепрессии концентрация белка RecA (обычно около 10 000 молекул на клетку) может возрастать в десятки раз. Однако для участия в расщеплении белка LexА или для инициирования рекомбинации белок RecA должен быть в активной форме, которая достигается его полимеризацией в присутствии ATP на онДНК. Таким образом, онДНК выступает в роли индуктора SOS-ответа, что не удивительно, так как в клетке естественными продуктами деградации ДНК, начинающейся после остановки ее синтеза, являются фрагменты онДНК. Экспрессия белка LexA также находится под контролем SOS-блоков. Следовательно, в результате антагонизма между расщеплением белка LexA и синтезом этого же белка осуществляется дополнительная регуляция клеткой глубины и продолжительности индукции SOS-ответа.Продукт гена recA связывается с одноцепочечными участками ДНК и в результате конформационного перехода обратимо превращается в активированную форму RecA*. Молекулы белка LexA диффундируют к RecA* и взаимодействуют с ним, что сопровождается протеолитическим расщеплением LexA вблизи середины его полипептидной цепи (связь Ala-84-Gly-85), что инактивирует LexA как репрессор. В результате происходит индукция LexA-зависимых генов SOS- регулона. В этой реакции белок RecA* не действует как протеиназа, но активирует криптическую протеиназную активность LexA, что завершается расщеплением полипептидной цепи репрессора по аутокаталитическому механизму. Действительно, репрессор LexA , связываясь с SOS-блоком (палиндромом длиною до 20 п.н.) в регуляторной части генов SOS-регулона, тормозит их экспрессию. Удивительна по разнообразию степень этого торможения, которая регулируется как количеством SOS- блоков, так и их "совершенством" (т.е. близостью к структуре идеального палиндрома), что, в конечном счете, позволяет поддерживать заданный уровень конститутивного синтеза конкретного белка.
Зачем природа создала столь сложный и тонко регулируемый механизм защиты клетки от гибели? Каковы его последствия? Они разнообразны: возрастает мутагенез как точечный, так и по типу сдвига рамки считывания [ Walker G.C., 1984 ], увеличивается частота хромосомных перестроек [ Dimpfl J. , Echols H., 1989 ], активируются специализированные системы делетирования ДНК [ Kuan C.-T., Tessman I., 1991 ], возрастает частота рекомбинационных обменов [ Бреслер С.Е., Ланцов В.А. 1978 ], становится возможной запрещенная межвидовая рекомбинация [ Rayssiguier C., Thaler D.S., ea., 1989 ].
Исследование мутантов E. coli, неспособных к SOS-ответу при УФ- повреждениях, привело к открытию еще одного локуса umuC. Оказалось, что этот локус является опероном, состоящим из двух генов - umuD и umuC . Потеря функции любого из генов приводит к подавлению SOS-ответа мутантных бактерий. Таким образом, umuCD-оперон , находящийся под контролем репрессора LexA, входит в состав SOS-регулона, и его функционирование абсолютно необходимо для SOS-мутагенеза. Во время SOS- ответа белок UmuD расщепляется по аутокаталитическому механизму, запускаемому RecA*. Образующийся полипептид UmuD' с молекулярной массой 12 кДа, включающий С-концевые остатки UmuD, оказался одним из самых важных компонентов системы SOS-ответа и SOS-мутагенеза у E. coli. Исследования мутантных производных UmuD показали, что его нативная форма не является просто неактивным предшественником белка UmuD', а выполняет функции репрессора SOS-ответа. В растворе UmuD и UmuD' существуют в виде гомодимеров и более стабильного гетеродимера UmuD-UmuD', каждый из которых может объединяться с белком UmuС . Комплекс (UmuD')2-UmuC запускает SOS-ответ, тогда как тримеры (UmuD)2-UmuC и UmuD-UmuD'-UmuC являются в этом отношении неактивными. Образование последнего гетеротримерного комплекса играет важную роль в прекращении клеткой SOS- ответа, так как в этом случае активные внутриклеточные UmuD' и UmuC выводятся из реакции.
Белок RecA в SOS-ответе участвует в формировании нуклеиново-белковых филаментов в местах одноцепочечных брешей на поврежденной ДНК. С этими филаментами могут соединяться белки UmuD' и UmuC в составе активного комплекса. В результате такого взаимодействия комплекс (UmuD')2-UmuC осуществляет переключение репаративного синтеза ДНК с гомологичной рекомбинации на SOS-мутагенез.
Среди других белковых компонентов системы SOS-мутагенеза E. coli необходимо отметить холофермент ДНК-полимеразы III , который проводит включение нуклеотидов в строящуюся цепь ДНК на поврежденном участке. Для нормального функционирования системы SOS-мутагенеза необходимы продукты генов groEL и groES , являющиеся молекулярными шаперонами. Их роль сводится к стабилизации и обеспечению правильного фолдинга белка UmuC.
Таким образом, синтез ДНК на поврежденном участке требует наличия белков UmuD', UmuC, RecA и холофермента ДНК-полимеразы III. Это было подтверждено при использовании бесклеточной системы, содержащей эти белки, а также фрагмент одноцепочечной ДНК с единственным мутантным сайтом без одного азотистого основания. Способность ДНК-полимеразы III преодолевать поврежденный участок ДНК в отсутствие UmuD', UmuC или RecA оценивается примерно в 0,5%, однако при наличии всех компонентов в реакционной смеси эффективность преодоления поврежденного участка увеличивалась в 10 раз. Очищенная ДНК-полимераза I не заменяет ДНК- полимеразу III в этих опытах. Настоящая роль белкового комплекса (UmuD')2-UmuC в данном процессе неизвестна. Предполагают, что комплекс может изменять процессивность ДНК-полимеразы, подавлять ее корректирующую 3'-5'-экзонуклеазную активность или изменять конформацию фермента на такую, при которой она начинает неадекватно оценивать пространственную структуру комплекса, образующегося с участием Уотсон- Криковских водородных связей между нуклеотидом матрицы и очередным входящим нуклеотидом. Любое из этих изменений должно сопровождаться повышением частоты ошибочного включения нуклеотидов. В 1998 г. установлено, что тример (UmuD')2-UmuC обладает слабой ДНК-полимеразной активностью и, возможно, именно этот комплекс осуществляет синтез ДНК непосредственно в поврежденном участке в присутствии всех вышеупомянутых компонентов. В этой связи тример получил название ДНК-полимеразы V Е. coli .
Белок Rev1 дрожжей , гомологичный белку UmuC E. coli , в очищенном состоянии обладает способностью неспецифически включать остатки dCMP в строящуюся цепь ДНК на участке матрицы, в котором отсутствуют азотистые основания, поэтому он был отнесен к ДНК-полимеразам и был назван дезоксицитидилтрансферазой .
Уникальными свойствами обладает новая ДНК-полимераза IV E. coli , кодируемая геном dinB , которая также участвует в SOS-ответе бактерий. Очищенная до состояния, близкого к гомогенному (1999 г.), она не обладает 3'-5'-экзонуклеазной активностью и способна включать нуклеотиды в строящуюся цепь ДНК по высокодистрибутивному механизму. При каждом фермента с субстратом и гибридом праймер-матрица к праймеру присоединяется единственный нуклеотид. Если вблизи 3'-конца праймера присутствует ошибочно спаренный нуклеотид (особенно пара G-G), то ДНК- полимераза IV в процессе синтеза ДНК осуществляет сдвиг рамки считывания в результате делеции одного нуклеотида. Такой механизм может потенциально исправить мутагенные последствия смещения 3'-конца праймера по отношению к правильной рамке считывания в поврежденной ДНК-матрице. Полагают, что если во время репликации участков ДНК с простыми повторяющимися последовательностями в результате их повреждения происходит включение неправильно спаренного нуклеотида с последующим проскальзыванием 3'-конца строящейся цепи ДНК и образованием мутации со сдвигом рамки считывания, то происходит задержка репликативного комплекса и его диссоциация. В этих условиях синтез ДНК может быть продолжен ДНК-полимеразой IV, которая путем внесения дополнительных мутаций может исправить первоначальный сдвиг рамки.
Механизм SOS-индуцированного мутагенеза выяснен, хотя и далеко не во всех деталях [ Friedberg E.C., Walker G.C., ea., 1991 , Woodgate R., Levine A.S., 1996 ].
Как оказалось, этот механизм имеет не менее тонкую регуляцию, чем описанный выше "глобальный" SOS-ответ клетки, так как его задача - заставить ДНК-полимеразу пройти повреждение даже ценой ошибки. Однако, как только повреждение пройдено, "мутагенная репарация", восстанавливающая синтез ДНК и спасающая клетку от гибели, должна быть прекращена.
Предполагается, что рассматриваемый процесс развивается в два этапа. На первом PolIII вставляет случайное основание напротив поврежденного (или напротив сайта, лишенного основания); на втором комплекс белков UmuD' и UmuС помогает полимеразе продолжить синтез ДНК после этой случайной вставки. С этой целью в районе повреждения на ДНК формируется мультиферментный комплекс, так называемая " мутасома ", имеющая в своем составе белки UmuD', UmuC, RecA и голофермент PolIII. Белки UmuD и UmuC кодируются генами umuD и , образующими оперон так, что структурная часть гена umuD перекрывает один нуклеотид последующего гена umuC. образом, оба белка синтезируются координированно, причем концентрация белка UmuD оказывается всегда на порядок выше концентрации UmuC. Оперон umuDC находится под контролем SOS-блока, который по своему составу только на 3 н. отличается от идеального палиндрома. Это приводит к жесткой закрытости оперона, который открывается одним из последних при индукции SOS-функций и требует сильного SOS-сигнала. Белок UmuD имеет значительную гомологию с С-концевой частью белка LexA, в которой расположен сайт его авторасщепления, стимулируемого белком RecA. Последний так же, как и в случае L exA, способствует расщеплению UmuD и образованию активного полипептида UmuD', входящего в состав мутасомы. Время полужизни белков UmuD и UmuC в клетке составляет лишь 6-7 минут. Действительно, мономеры UmuD и UmuC взаимодействуют с протеазой Lon и деградируют. UmuD спасается от протеолиза в форме димера UmuD2. UmuC временно продлевает свое существование, защищаясь белками-шаперонами GroEL и GroES. Хотя UmuD' легко димеризуется и не является субстратом каких-либо протеаз, но этот мономер также легко образует гетеродимер UmuDD', который подвергается протеолизу ATP-зависимой сериновой протеазой ClpXP . Предполагается, что с помощью этого гетеродимера белки UmuD' выводятся из реакции. Такой сложный комплекс белок-белковых взаимодействий, схематически представленный на рис. 1а , имеет целью подавить возможность образования мутасомы при базальном уровне белков UmuD и UmuC в нормальной клетке (по 200 и 16 молекул на клетку соответственно) или в случае слабого SOS-сигнала. В случае сильного SOS- ответа, когда концентрация белков UmuD и UmuC возрастает на порядок, достаточно быстро возникает стабильный комплекс UmuD2'C ( рис. 1б ), который, предположительно, передает мономер UmuC на комплекс белка UmuD' и белка RecA* (активная форма), чтобы образовать искомую мутасому RecA* + UmuD'C + PolIII. При этом наиболее простой представляется следующая цепь событий: повреждение ДНК, остановка синтеза ДНК, деградация ДНК с образованием онДНК, запуск SOS-ответа, полимеризация белка RecA в присутствии ATP на онДНК в месте повреждения (т.е. образование активной формы RecA*), взаимодействие RecA* с белком UmuD, появление UmuD', взаимодействие UmuD' и PolIII для продолжения синтеза ДНК без коррекции дефекта.
Как видно, белок RecA принимает участие в трех разных событиях: он индуцирует синтез белков UmuD и UmuC, расщепляет UmuD до активной формы UmuD' и обозначает место сборки мутасомы. Однако в основе этих событий лежит лишь одно свойство белка RecA - способность образовывать активный филамент в составе тройного комплекса RecA::ATP::онДНК. Это же свойство оказывается достаточным, чтобы объяснить и другие события SOS-ответа, приводящие к изменчивости генома, такие, как повышенная частота рекомбинационных обменов, хромосомные перестройки и межвидовая рекомбинация.
По своим последствиям SOS-система является прямым антагонистом системы КНО - если последняя способствует сохранению точности воспроизведения генома, то первая способствует его изменчивости. Наиболее определенно этот антагонизм нашел свое выражение в межвидовой рекомбинации, осуществляющей "горизонтальный" перенос генетической информации. Как отмечалось выше, эта рекомбинация подавляется системой КНО. Однако она усиливается при индукции SOS-ответа вообще и повышенного синтеза белка RecA и белков RuvAB в частности [ Matic I., Rayssiguier C., Radman M., 1995 ] (комплекс RuvAB в ходе recA-зависимой рекомбинации осуществляет миграцию ветви ДНК даже через области ДНК с несовершенной гомологией). Более того, в отличие от внутривидовой рекомбинации межвидовая сопровождается recB-зависимой индукцией системы SOS [ Matic I., Rayssiguier C., Radman M., 1995 ]. В данном случае нуклеаза RecBCD выступает не только в роли "рекомбиназы", но и "ДНК-деградазы", что приводит к появлению индукторов SOS-ответа. Спрашивается, почему в природе сохранилась способность к межвидовой рекомбинации, поддерживаемая специализированной системой SOS? К настоящему времени стала очевидной наивность представлений о том, что эволюционная специализация генома или даже шоковая адаптация к изменившимся внешним условиям происходит путем постепенного накопления необходимого числа мутаций для перехода гена и его продукта в новое качество [ Gould S.J., Eldredge N., 1993, Gorshkov V.G., 1995 ]. Ясно, что только горизонтальный перенос блоков, составляющих гены, или даже целых генов, может обеспечить моментальное приобретение искомого качества. Гарантом сохранения вида является "дивергенция" нуклеотидной последовательности ДНК, которая используется системой ДКНО для предотвращения межвидовой рекомбинации. Отмечено, что у бактерий значительно меньшей дивергенцией обладают гены (до 35% генома), обмен которыми облегчает адаптацию к внешним условиям даже на фоне целостной системы MutHLSU. В природной популяции E. coli до 1% клеток имеют мутаторный фенотип [ Trobner W., Piechocki R., 1994 ]. Таково условие выживания данной популяции. В благоприятных же условиях число клеток-мутаторов снижается на несколько порядков. Следовательно, для постоянно идущего процесса эволюционной изменчивости более выгодны стрессовые ситуации, предусматривающие, в частности, межвидовой обмен генетическим материалом. Это и обеспечивает индуцибельная система SOS. Две противоположные по задачам системы - MutHLSU и SOS - создают возможность поддержания изменчивости клетки при сохранении ее видоспецифичности.
Итак, SOS-система - генетическая программа изменения ДНК путем ее мутагенной репарации или рекомбинации с целью адаптации клетки к изменившимся внешним условиям, результатом чего является наращивание ее эволюционного потенциала.
Смотрите также:
