РНК редактирование мРНК хлоропластов: специфичность
Проблема специфичности, т.е. нахождения сайтов эдитинга, не решена ни для митохондриальной, ни для пластидной мРНК растений. Несмотря на то. что число таких сайтов в геноме пластид в десятки раз меньше, чем у митохондрий, до сих пор не удалось найти ни консенсусных последовательностей, ни gPHK-подобных молекул. Безуспешными пока остаются попытки создать систему in vitro для изучения эдитинга пластидной мРНК. Зато весьма информативным оказалось использование трансформации пластид для исследования эдитинга [ Bock ea 1994 ]. Так, с помощью трансформации в пластоме табака ген psbF был модифицирован в шпинатный, который отличается от табачного одним нуклеотидом. У шпината в MPHKpsbF происходит эдитинг этого нуклеотида, в результате чего кодон UCU превращается в UUU (Ser замещается на Phe). У табака в данном сайте эдитинг отсутствует, так как триплет UUU кодируется геномно. "Шпинатный" кодон UCU гена psbF не редактировался в пластидах табака, что приводило к замедлению роста, снижению концентрации хлорофилла и некоторым другим аномалиям. Данный эксперимент явился первым прямым доказательством роли редактирования в синтезе функционально полноценных белков пластид, а также продемонстрировал необходимость каких-то цис- и транс-факторов, необходимых для эдитинга и отсутствующих в рассмотренной системе [ Bock ea 1994 ].
В дальнейших исследованиях частичного восстановления способности к редактированию удалось достигнуть в результате слияния трансформированных табачных клеток со шпинатными протопластами. Авторы делают вывод о наличии транс-факторов в ядре шпината, которые и определяют специфичность редактирования [ Bock ea 1997 ]. Природа этих транс-факторов остается неизвестной. Успешными были исследования по определению цис-элементов, контролирующих специфичность эдитинга. Используя метод трансформации хлоропластной ДНК, удалось установить, что цис-активные элементы для эдитинга инициирующего кодона psbL транскрипта табака расположены в пределах 98-нуклеотидного фрагмента, окружающего сайт. Оказалось также, что наличие трансформированного psbL-гена снижает эффективность редактирования эндогенной psbL мРНК, не влияя при этом на редактирование других мРНК. Авторы делают вывод о том, что дополнительная (трансгенная) и собственная psbL мРНК молекулы конкурируют за специфический трансфактор эдитинга, природа которого неясна [ Chaudhuri ea 1995 ].
В пользу существования транс-факторов, контролирующих эдитинг в пластидах, свидетельствуют также данные о сравнении сайтов эдитинга гроВ транскриптов у ячменя и кукурузы: один из четырех соответствующих сайтов у ячменя не редактируется, хотя фланкирующие последовательности (19 предшествующих нуклеотидов и 24 нижележащих) в точности идентичны таковым у кукурузы, у которой эдитинг происходит. Предположительно, наряду с цис-последовательностями, фланкирующими сайт эдитинга, существуют какие-то узнающие элементы, которые у ячменя для данного сайта оказались, вероятно, в ходе эволюции потеряны [ Zeltz ea 1993 ]. Цис-элементы, контролирующие эдитинг ndhB - самого интенсивно редактируемого из всех пластомных генов ( рис. 5 ), - анализировались при изучении транспластомных растений табака in vivo. Создавали химерные конструкции из изучаемых сайтов эдитинга и фланкирующих их последовательностей разной длины. Неожиданно было показано, что разные сайты эдитинга одного и того же гена нуждаются в совершенно разных по длине (или по удаленности от сайта) цис-элементах. При этом замена или делеция нуклеотида в положении -1 (предшествующего сайту эдитинга) резко и избирательно подавляла редактирование в данном сайте, т.е. положение 5' нуклеотида, ближайшего к любому сайту эдитинга, является критическим. Для двух соседних сайтов эдитинга ndhB-гена установлена общая цис- последовательность длиной 11 нуклеотидов, фланкирующая 5'-конец и контролирующая редактирование обоих. Данная 11-членная последовательность напоминает критическую " mooring sequence" в ароВ мРНК млекопитающих см. " Механизм редактирования ароВ мРНК "). По аналогии с ароВ предполагается, что данная последовательность служит связующим звеном между мРНК и гипотетической "эдитосомой" [ Bock ea 1996 ].
В дальнейшем было установлено, что расстояние между 11-членной цис- последовательностью и двумя сайтами эдитинга, которые она контролирует, является критическим. Только те цитидины, которые находятся на определенном "правильном" расстоянии от этой 5'-фланкирующей последовательности, узнаются системой эдитинга, причем расстояние это контролируется чрезвычайно точно. Удалось добиться эдитинга "неправильного" цитидина, поместив его на нужном расстоянии от вышележащей цис-последовательности ( рис. 6 ). Таким образом, механизм редактирования в пластидах имеет некоторое сходство с apoB-редактированием у млекопитающих: мРНК молекулы несут цис-элементы, определяющие связывание с гипотетической эдитосомой (а возможно, и сборку самой эдитосомы), транс-элементы неизвестной пока природы выполняют роль "указателей" сайта эдитинга [ Hermann ea 1999 ].
Изменение или удаление нуклеотидов З'-фланкирующего района почти не влияло на эдитинг изученных сайтов [ Bock ea 1996 ]. О важности 5'-фланкирующего участка в контроле эдитинга митохондрий упоминалось выше. Был выполнен компьютерный скрининг хлоропластного генома табака, чтобы установить, является ли данная последовательность общей при редактировании разных мРНК пластид, или она сайт-специфична. Не удалось выявить гомологичных последовательностей, 5'-фланкирующих другие сайты эдитинга в хлоропластах. По-этому предполагается, что выявленная последовательность индивидуальна для данной пары близко расположенных сайтов, она связывается со специфическими транс-факторами (пока не найденными - см. [ Chaudhuri ea 1995 ] ), которые и запускают эдитинг [ Bock ea 1996 ]. В процессе поиска транс-факторов эдитинга предпринято несколько попыток найти gPHK в пластидах. Фракции низкомолекулярных РНК анализировались путем гибридизации, осуществлялся компьютерный поиск возможных кандидатов на эту роль в пластоме, методом "нокаута" (избирательного разрушения [ Rochaix ea 1997 , Bock ea 1999 ]) исследовался также участок пластома табака, предположительно кодирующий gPHK для эдитинга psbL-гена. Однако все эти попытки до сих пор не привели к обнаружению gPHK молекул в пластидах, и поиск факторов специфичности продолжается [ Bock ea 1997 , Hermann ea 1999 ].
Смотрите также:
