Косупрессия у растений: основные свойства
Параллельно развивающиеся исследования косупрессии у растений показали большую сложность этого феномена. Было также показано, что сходное с косупрессией явление способны вызывать многие РНК-содержащие вирусы растений, обычно имеющие в своем жизненном цикле стадию двухцепочечной РНК ( Longstaff et al., 1993 ). При этом размножение вируса, содержащего в своем геноме участок гомологии с каким-либо геном генома хозяина, вызывало подавление экспрессии этого гена. С другой стороны, наличие трансгена в геноме растения часто останавливало размножение такого вируса и приводило к устойчивости растения к инфекции.
Способность трансгена вызывать подавление экспрессии клеточного гена зависит от многих факторов: структуры трансгена, сайта инсерции и наличия дополнительных перестроек трансгена в геноме, а также уровня его экспрессии; в большинстве случаев была показана необходимость транскрипции трансгена для подавления экспрессии клеточного гена ( Mette et al., 1999 ).
Однако уровень экспрессии трансгена не обязательно должен быть высоким, хотя этот вопрос осложняется тем, что при косупрессии экспрессия самого трансгена обычно также оказывается подавленной.
В единичных случаях была показана способность несодержащих промотор трансгенов вызывать косупрессию, однако и в этом случае нельзя полностью исключить транскрипцию трансгена с соседних промоторов в сайте инсерции ( Voinnet et al., 1998 ).
Косупрессию способны вызывать трансгены, транскрибирующиеся как в смысловой, так и в антисмысловой ориенетации, иногда эффективной оказывалась именно комбинация смысловых и антисмысловых трансгенов в одном геноме ( Waterhouse et al., 1998 ).
В результате трансгеноза обычно получается несколько содержащих трансген линий растений, различающихся по своей способности вызывать косупрессию. Разница в способности к косупрессии может объясняться влиянием сайта инсерции (например, наличие рядом клеточного промотора), различием в копийности трансгенов, а также наличием вторичных перестроек трансгена в геноме. Часто сила подавления экспрессии растет с увеличением количества трансгенов в геноме, и косупрессия проявляется только в линиях, содержащих многокопийные трансгены.
Анализ дополнительных перестроек трансгенов в геноме показал, что наиболее эффективными оказываются трансгены, образующие инвертированные повторы, с которых может транскрибироваться РНК, способная образовать структуру, идентичную двухцепочечной РНК ( Mette et al., 1999 ). Специально полученные конструкции, содержащие шпилечные структуры, образующие двухцепочечные РНК, всегда оказывались очень эффективными ( Chuang and Meyerowitz, 2000 ; Escobar et al., 2001 ; Mette et al., 2000 ; Smith et al., 2000 ).
Когда наличие трансгена само по себе не приводило к косупрессии, она могла индуцироваться введением в трансгенные растения реплицирующегося вируса, содержащего гомологичную последовательность, или просто нереплицирующейся ДНК, которая не встраивалась в геном ( Voinnet et al., 1998 ). ДНК может быть введена инфильтрацией культуры Agrobacterium tumefaciens (в клетку при этом проникает одноцепочечная ДНК) или бомбардировкой золотыми частицами, содержащими кольцевые или линейные молекулы ДНК ( Voinnet et al., 1998 ).
При косупрессии эффективными в подавлении экспрессии эндогена оказывались трансгены, содержащие как транскрибируемые участки гена, так и нетранскрибируемые промоторные области. В обоих случаях присутствие трансгена и установление репрессии корреллировало с метилированием остатков цитозина в составе симметричных и несимметричных последовательностей. Как в случае транскрибируемых, так и в случае нетранскрибируемых последовательностей метилирование было ограничено областью гена, в которой присутствовала гомология между трансгеном и эндогеном (или двумя трансгенами).
Оказалось, что вирусы, реплицирующиеся в цитоплазме, также были способны индуцировать метилирование участка эндогена, гомологичного последовательности, содержащейся в геноме вируса.
Вопреки распространенным представлениям о том, что метилирование всегда вызывает подавление транскрипции, прямые измерения транскрипционной активности подавляемых генов методом run-off (остановленной транскрипции) показало, что уменьшение транскрипции имеет место только в случае гомологии и, соответственно, метилирования в промоторной нетранскрибируемой области гена. Гомология и, соответственно, метилирование транскрибируемой части гена не приводит к подавлению его транскрипции, что свидетельствует о том, что в этом случае подавление экспрессии происходит на пост-транскрипционном уровне, скорее всего на уровне деградации мРНК.
Таким образом, различные случаи косупрессии могут быть разделены на пост-транскрипционное подавление экспрессии генов (PTGS) (post-transcriptional gene silencing) и транскрипционное подавление экспрессии генов (TGS) (transcriptional gene silencing).
Смотрите также:
