RISC (siRNP) и RISC* комплекс деградации РНК
Комплекс, осуществляющий деградацию мРНК , получил название RISC (RNA-induced silencing complex) или siRNP (small interfering ribonucleoprotein particle) т.к. было показано, что он содержит siRNA , образованные, по-видимому, в результате активности DICER на предыдущей стадии РНК-интерференции ( Hammond et al., 2000 ; Zamore et al., 2000 ). Наличие РНК-компонента в комплексе RISC абсолютно необходимо для его нуклеазной активности, которая исчезает при обработке экстракта микрококковой нуклеазой, но не ДНКазой I ( Hammond et al., 2000 ).
Было показано, что для включения в состав комплекса RISC siRNA должны содержать 5'-фосфат на обеих цепях siRNA-дуплекса, при этом нефосфорилированные искусственно синтезированные siRNA оказываются фосфорилированы благодаря наличию в экстракте киназы ( Nykanen et al., 2001 ). Специфичность такой киназы отличается от действия полинуклеотидкиназы (PNK) E. coli в том, что она не может фосфорилировать 5'-дезоксинуклеотидный остаток. Авторы предполагают, что узнавание 5'-фосфата перед включением в состав RISC играет функцию дополнительного распознавания "истинных" молекул siRNA от других коротких РНК, образующихся в клетке. В этом случае, такое распознавание должна производить и киназа, поддерживающая наличие 5'-фосфата в siRNA.
Скорее всего, в составе комплекса RISC две цепи siRNA продолжают находиться в спаренном состоянии. В пользу этого свидетельствует частичная устойчивость siRNA к действию РНКазы A и T1 ( Hammond et al., 2000 ; Yang et al. 2000 ). Кроме того, данные о том, что избыток антисмысловой РНК может препятствовать деградации гомологичной мРНК, указывают на присутствие в одном рибонуклеазном комплексе как смысловой, так и антисмысловой цепи ( Yang et al. 2000 ).
Очищенные или искусственно синтезированные siRNA при добавлении к эмбриональному экстракту включаются в состав комплекса размером приблизительно в 360 кДа в отсутствии ATP, однако такой комплекс неспособен осуществлять дальнейшую деградацию мРНК ( Nykanen et al., 2001 ).
В присутствии ATP большая часть siRNA также оказывается в составе неактивного, весом в 360 кДа комплекса и лишь незначительная часть siRNA - в составе комплекса весом менее 232 кДа, активного в отношении деградации мРНК.
Оказалось, что неактивный (360 кДа) комплекс содержит siRNA в неденатурированном (двухцепочечном) состоянии, в то время как активный комплекс меньшего размера содержит siRNA в одноцепочечном виде.
Очевидно, что ATP необходим для конформационной перестройки комплекса, включающей расплетание дуплекса siRNA.
Комплекс RISC, содержащий siRNA в денатурированном состоянии является, по-видимому, стабильным, т.к. остается активным при удалении ATP. Возможно, что активный комплекс RISC содержит только одну цепь siRNA, на что указывают исследования in vivo, свидетельствующие о том, что после инъекции двухцепочечной РНК в C. elegans обнаруживаются siRNA, соответствующие преимущественно антисмысловой цепи ( Tijsterman et al., 2002 ).
Дальнейшие после формирования активного комплекса стадии узнавания и расщепления мРНК также не требуют присутствия ATP ( Nykanen et al., 2001 ). Авторы предполагают, что 232 кДа siRNP представляет собой минимальный активный комплекс и назвали его RISC*.
Следует отметить, что активный RISC, выделенный из культуры клеток дрозофилы другой группой исследователей, имел размер приблизительно в 500 кДа ( Hammond et al., 2000 ). Размер продуктов деградации одноцепочечной РНК (21-23 нуклеотидов) близок к длине siRNA. Первый разрыв при расщеплении одноцепочечной РНК вносится на расстоянии 7-10 нуклеотидов от начала области гомологии с двухцепочечной РНК как в случае смысловых так и антисмысловых РНК-мишений ( Elbashir et al., 2001b ).
Смотрите также:
