PTGS: распространение сигнала сайленсинга
Исходно распространение сигнала системного сайленсинга было обнаружено в опытах на растениях, содержащих трансгены, вызывающие косупрессию эндогенного гена. При прививании части растения, в котором PTGS полностью отсутствовал, к растению с функционирующим PTGS, репрессия вскоре обнаруживалась в привитой части ( Palauqui et al., 1997 ). При этом следует отметить, что для косупрессии эндогенного гена обе части (привой и подвой) должны были содержать экспрессирующийся трансген, но до прививания трансген в привое не мог вызвать репрессию эндогена.
Таким образом, сигнал, поступающий от части растения с установившемся PTGS, вероятно приводит к запуску процесса косупрессии в привое, но сам по себе он недостаточен для репрессии в отсутствии экспрессирующегося трансгена.
Были определены следующие свойства распространения сигнала системного сайленсинга:
- сигнал способен передаваться на большие расстояния по сосудистой системе (флоэме), а также от клетке к клетке по плазмодесмам ( Voinnet et al., 1998 );
- в работе Palauqui с соавт. показано, что сигнал способен передаваться по растению только снизу вверх ( Palauqui and Vaucheret, 1998 ). Однако в другой работе было установлено двунаправленное распространение сигнала из области первичного заражения ( Voinnet et al., 1998 );
- сигнал может передаваться на большие расстояния (30 см) через участки растения, не содержащие трансген, пока вновь не достигнет трансген-содержащую часть ( Palauqui and Vaucheret, 1998 ; Voinnet et al., 1998 ).
Распространение сигнала при индуцированном вирусами PTGS довольно сложно продемонстрировать, поскольку вирусы способны сами распространяться по растению от исходного места заражения.
Эту проблему удалось решить, используя вирусы, нормально реплицирующиеся и инфицирующие растение в месте заражения, но неспособные распространяться далее из-за отсутствия белка оболочки ( Voinnet et al., 2000 ). Было продемонстрировано, что заражение таким вирусом, несущим участок гомологии с эндогеном, приводило к распространению PTGS эндогена от исходного места заражения вирусом.
Следует отметить, что в этом случае, в отличие от описанной перед этим работы, сигнал системного сайленсинга был достаточен для запуска репрессии эндогена в новом месте при отсутствии дополнительных факторов. Однако при этом репрессия распространялась лишь на небольшое расстояние и только вдоль жилок листа растения.
Наличие в растении трансгена, который до этого не вызывал репрессию, значительно усиливает действие сигнала PTGS, поступающего от места заражения вирусом, несущего гомологичную трансгену последовательность ( Voinnet et al., 2000 ). При этом наблюдается полное подавление экспрессии трансгена во всех вышерасположенных от места инфекции вирусом тканях.
Таким образом, в обоих случаях - при PTGS вызванном трансгеном или вирусом - сигнал системного сайленсинга, распространяющийся из ткани, в которой осуществляется репрессия, в первую очередь индуцирует запуск процесса PTGS на новом месте.
В связи с эти представляется интересным вопрос, способна ли репрессия поддерживаться на новом месте в отсутствии постоянно поступающего сигнала системного сайленсинга?
В своей работе Voinnet с соавт. исследовали PTGS трансгена GFP , вызванный либо инфильтрацией Agrobacterium, либо бомбардировкой частицами золота с кольцевой или линейной ДНК ( Voinnet et al., 1998 ). В обоих случаях удаление через 2 дня обработанных листьев не препятствовало распространению репрессии трансгена по всему растению. При этом скорость распространения и сила репрессии была одинаковой в сравнении с растениями, где обработанные листья были оставлены.
В работе Palauqui с соавт. в результате трансгеноза были получены линии, содержащие экспрессирующийся трансген, но отличающиеся по способности индуцировать косупрессию эндогена ( Palauqui and Vaucheret, 1998 ). В части линий обнаруживалось спонтанное возникновение косупрессии в определенном проценте растений, в то время как в других линиях, косупрессия никогда не возникала. Неспособные к косупрессии растения, а также не проявляющие репрессии, но потенциально способные к ней растения, использовались в качестве доноров отростков, которые прививались на растения, проявляющие PTGS. В обоих случаях благодаря наличию сигнала системного сайленсинга наблюдалось распространение косупрессии в привой.
Последующее перенесение привоя на растение дикого типа приводило к сохранению репрессии в отростке, взятом от растения, потенциально способном к самостоятельной инициации косупрессии, в то время как в отростке от растения, неспособного к инициации PTGS, косупрессия постепенно исчезала.
Аналогично растениям, неспособным к самостоятельной инициации косупрессии, но содержащим трансген, вели себя отростки от растений, вообще не содержащих трансгена, но обладающих повышенным уровнем экспрессии клеточного эндогена из-за нарушенной системы регуляции.
Эти опыты позволяют сделать вывод, что сигнал системного сайленсинга может индуцировать деградацию РНК в ткани, не способной к самостоятельной инициации PTGS, однако в этом случае репрессия не поддерживается после удаления источника сигнала. Что подтверждает существование трех стадий PTGS: инициации, собственно деградации мРНК и поддержания репрессии, при этом наблюдается прямая связь между способностью к инициации PTGS и способностью к его поддержанию.
По-видимому, неспособные к инициации PTGS растения не способны также воспроизводить сигнал системного сайленсинга и поэтому теряют репрессию после удаления его источника.
Такой вывод предполагает, что сигнал системного сайленсинга нужен не только для распространения репрессии по растению, но также и для длительного поддержания репрессии внутри ткани.
Действительно, наличие отдельных стадий инициации и поддержания репрессии было обнаружено при изучении локальной косупрессии, при этом также было определено различие в способности трансгена и клеточного эндогена поддерживать репрессию после ее инициации.
При PTGS трансгена GFP , индуцированного GFP-содержащим вирусом были обнаружены две стадии: вирус-зависимая инициация репрессии и дальнейшее вирус-независимое поддержание PTGS, коррелирующее с метилированием трансгена GFP ( Jones et al., 1999 ; Ruiz et al., 1998 ).
В противоположность этому при вирус-индуцированном PTGS клеточного эндогена это не наблюдается - репрессия всегда остается вирус-зависимой, и метилирования эндогена не происходит ( Jones et al., 1999 ; Ruiz et al., 1998 ).
Полученные результаты показывают связь между поддержанием репрессии и метилированием. При системном PTGS распространение репрессии от области первоначального заражения коррелирует с метилированием кодирующей части трансгена в тканях, подверженных PTGS ( Jones et al., 1999 ). При изучении PTGS, вызванного инфекцией вирусом (PSbMV, potyviridae) растения, несущего гомологичный вирусу трансген, было обнаружено естественное (независимо от наличия трансгена и PTGS) ограничение инфекции - вирус не обнаруживался в меристемных тканях ( Jones et al., 1998 ). Несмотря на это, PTGS трансгена происходит во всех тканях, включая меристемные, что указывает на наличие сигнала системного сайленсинга, распространяющегося от инфицированных тканей в меристемным.
Известно и то, что метилирование трансгена начинается также в меристемных тканях т.е. индуцируется не самим вирусом, а тем же сигналом сайленсинга, запускающим PTGS ( Jones et al., 1998 ). Авторы предполагают, что метилирование трансгена облегчено именно в меристемной ткани, содержащей делящиеся клетки, в которых отсутствие ядерной оболочки во время митоза облегчает доступ сигнала сайленсинга в ядро.
Однако в других работах было показано, что активно пролиферирующие ткани вообще не способны к осуществлению PTGS ( Mitsuhara et al., 2002 ).
Смотрите также:
