Методы обрыва цепи (chain termination method)
Метод обрыва цепи (chain termination method) [греч. methodos — способ познания] — метод, применяемый при определении нуклеотидной последовательности ДНК (см. Секвенирование ДНК), который основан на полимеразной цепной реакции (см. Полимеразная цепная реакция, ПЦР). В качестве матрицы в этой реакции используется одноцепочечная ДНК, нуклеотидную последовательность которой надо определить. Первоначально матрицу гибридизуют с коротким праймером, связывающимся с ее 3'-концом. Затем в реакционную смесь добавляют четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (дНТФ) и один из четырех дидезоксирибонуклеозидтрифосфатов (ддНТФ). Остановка синтеза новой цепи ДНК-полимеразой (обрыв цепи) будет происходить всякий раз, когда вместо дНТФ в растущую цепь ДНК будет встраиваться соответствующий ему ддНТФ. Для определения последовательности нуклеотидов необходимо осуществить четыре отдельные реакции в присутствии каждого из четырех ддНТФ. Затем четыре пробы вносят в соседние лунки пластины геля и проводят гель-электрофорез, в котором длина пробега каждого компонента обратно пропорциональна длине цепи. Как только фрагменты ДНК визуализированы, нуклеотидную последовательность можно прочесть прямо в геле снизу по направлению к старту в соответствии с очередностью, в которой фрагменты располагаются на отдельных «дорожках». М.о.ц. предложен Ф. Сенгером в 1975 г. (Нобелевская премия за 1980 г. совместно с У. Гилбертом и П. Бергом).
Смотрите также:
