Невирусные векторы для генной терапии
[ Crystal ea 1995 , Cotten, ea 1993 , Perales ea 1994 ].
Невирусные подходы к доставке генов развивают многие лаборатории. Привлекает в них несколько вещей. Во-первых - это не вирусы, и, значит, опасности, о которых мы говорилось в разделе о вирусных векторах, пациентам не грозят. Это простые системы и в них можно помещать сколь угодно большие ДНК. Естественно, тут же возникают проблемы доставки. Куда-то надо ее, эту невирусную систему, вводить пациенту, и при этом, чтобы она попала в то место, в те клетки, где она нужна. Допустим, как она будет вести себя в крови? Что с ней будет вытворять иммунная система? ДНК должна быть упакована в таком виде, чтобы она связывалась с клетками мишенями и желательно не связывалась с другими клетками.
Успешная доставка длинной нестабильной полианионной молекулы ДНК в клетку-мишень через три липидных бислоя , т.е. клеточную мембрану и двойную ядерную мембрану требует специальных ухищрений.
Во-первых, надо создать условия, при которых ДНК не подвергалась бы деградации, механической и энзиматической.
Во-вторых, сделать так, чтобы эта ДНК выживала перед тем, как она доберется до клеточного ядра, Это значит, что когда ДНК попадает в клетку, она должна избежать эндосом и лизосом и найти путь к ядру.
И конечно, нужно обеспечить долговременную экспрессию генов, содержащихся в ДНК. В основном для этих целей используют две главные стратегии.
В первой из них образуют катионные липидсвязанные комплексы с ДНК в составе липосом . Эти комплексы положительно заряжены. Они связываются с клетками мишенями. Они содержат липиды со свойствами сплавляться с клеточными мембранами и облегчать проникновение ДНК в клетки. В частицах не содержится информации, направляющей их прямиком в ядро. Поэтому большая часть генного иатериала, проникшего в клетку оказывается связанной с цитоплазматическими органеллами и уничтожается. Только небольшая часть избегает этой участи.
Во второй стратегии используют имитацию вирусов. В этом случае ДНК вводят в комплекс с поликатионом (например, полилизином), лигандом для связывания с клеткой и эндоцитоза (таким лигандом может быть, например, трансферрин или антитело, специфичное к какому-либо поверхностному белку клетки) и специальным агентом, облегчающим высвобождение ДНК из этого комплекса и эндосом в цитоплазме. Такие агенты называют эндосомолитическим . Ими могут служить репликационно-дефектные аденовирусные частицы, влючаемые в комплекс. Для увеличения безопасности таких систем пытаются использовать аденовирусы животных, не способные реплицироваься в человеческих клетках. Лиганд, введенный в комплекс, определяет клеточную специфичность доставки ДНК.
При явных достоинствах, системы невирусной доставки имеют и серьезные недостатки. Они малоэффективны. Требуется очень высокая концентрация частиц, чтобы перенос гена осуществился. Пока неясно, как обстоит дело с проблемами безопасности при их использовании. Пока эти системы испытывались на людях только в стратегии in vivo. Многие склонны считать, что идеальным для целей генной терапии соматических клеток был бы вектор, имитирующий хромосому человека. Такие векторы могли бы быть созданы по образу и подобию природных хромосом, также как созданы дрожжевые искусственные хромосомы - YAC. Для этого они должны содержать три функциональных элемента: Участок, обеспечивающий репликацию (origin of replication) Последовавтельность, обеспечивающую митотическую стабильность - центромеру. Последовательность, обеспечивающую правильную репликацию и устойчивость к нуклеазам - теломеры. Полагают, что такие искусственные хромосомы для клеток млекопитающих появятся в ближайшее время [ Обозрение 1995 ].
Смотрите также:
