Таргетинг: метод позитивно-негативной селекции
Для тартегирования неселектируемых генов был разработан метод позитивно-негативной селекции ( Mansour S.L., ea., 1988 ). Суть его заключается в использовании как позитивной, так и негативной селекции за счет 2 селектируемых генов, расположенных в разных местах вектора. Данный метод в принципе применим к любому гену. С помощью позитивной селекции на один из селектируемых генов (чаще всего для этой цели используют ген neo), расположенный в векторе, как правило, в кодирующей последовательности гена и, таким образом, инактивирующий данный ген, отбирают все клоны с интегрированным вектором.
Негативную селекцию, позволяющую отличить клоны с гомологичной рекомбинацией от клонов со случайно встроенным вектором, осуществляет другой селективный маркер (таким может быть, например, ген tk HSV), расположенный на самом конце вектора вне области гомологии. Этот ген элиминируется при гомологичной рекомбинации, но присутствует при случайном встраивании вектора, уничтожая при этом клоны за счет своего цитотоксического эффекта в присутствии специальных реагентов, например ганцикловира ( рис.2 ). Такая стратегия была испытана на ряде неселектируемых генов, и во всех случаях было получено обогащение клонами с гомологичной рекомбинацией, которое варьировало от 15 до 10 000 раз ( Capecchi M.R., 1989 ; Mansour S.L., ea., 1988 ; Mansour S.L., ea., 1990 ; McMahon A.P., ea ., 1990 ).
В дальнейшем первоначально сконструированную кассету p MCLneo ( Thomas K.R., ea., 1990 ) , о структуре которой речь шла выше, модифицировали за счет добавления к ней сайта полиаденилирования из гена tk HSV ( кассета pMCLneopA ). Эту кассету часто используют и в настоящее время, хотя позднее выяснилось, что на экспрессию гена neo в данном конструкте сильное влияние оказывают эффект положения ( Hasty P., ea., 1991 ; Soriano P., ea ., 1991 ; te Riele H., ea ., 1992 ) и транскрипционная интерференция при совпадении направления его экспрессии с направлением экспрессии таргетируемого гена ( Shaw-White J.R., ea., 1993 ). Все это чрезвычайно важно, поскольку из-за неэффективной экспрессии гена neo гомологичная рекомбинация в некоторых случаях может вообще не выявляться ( te Riele H., ea., 1992 ).
При осуществлении гомологичной рекомбинации с геном wnt-1 впервые вместо вирусных регуляторных элементов маркерный ген neo был поставлен под управление промотора конститутивно экспрессирующегося активного гена крыс ( McMahon A.P., ea., 1990 ). В результате произошло усиление эффективности тестируемой трансфекции в 11 раз. Позднее P. Soriano и соавт. ( Soriano P., ea., 1991 ) показали, что эффективность вектора увеличивается в 36 раз, если в кассете pMCLneopA вирусный сайт полиаденилирования заменить аналогичный сайтом из гена гормона роста быка . В этой же работе впервые была использована в качестве промотора для гена neo промоторная область гена фосфоглицераткиназы-1 - pgk ( кассета PGKLneo ).
Сконструированные на основе таких кассет векторы (вместе с небольшими модификациями гена neo) оказались в некоторых случаях в десятки раз более эффективными для выявления гомологичной рекомбинации, чем при использовании кассеты pMCLneo ( Rudnicki M.A., ea., 1992 ) . При этом экспрессия гена neo не подвержена эффекту положения. В настоящее время в некоторых случаях вместо pgk-neo используют конструкт pgk-hprt ( Matzuk M.V., ea., 1995 ).
Смотрите также:
