Тропонин C: конформационные изменения при связывании Ca2+
Инициация мышечного сокращения начинается с насыщения регуляторных центров тропонина С ионами Са2+ . Поэтому для понимания процессов, лежащих в основе регуляции мышечного сокращения, было необходимо проследить за изменениями структуры, происходящими при связывании Са2+ тропонином С. Методом рентгеноструктурного анализа удалось установить структуру тропонина С, в котором N-концевые регуляторные участки не содержали связанного Са2+, а С-концевые участки были насыщены Са2+ [ Herzberg, ea 1985 ]. При этом оказалось, что структуры N-и С-концевых доменов существенно отличаются друг от друга. Главное различие состояло в том, что в насыщенном ионами Са2+ С-концевом домене спирали, ограничивающие Са- связывающие участки (спирали F, G, Н), находились почти под прямым углом к центральной спирали, а в N-концевом домене, свободном от ионов Са +, спирали В и С располагались почти параллельно центральной спирали. Херцберг, Моулт и Джеймс [ Herzberg, ea 1986 ] высказали предположение, что при насыщении регуляторных центров структура N-концевого глобулярного домена станет похожей на структуру С- концевого домена. Таким образом, постулировалось, что связывание Са2+ регуляторными центрами приведет к удалению спиралей В и С от центральной спирали, при этом спирали В и С ориентируются почти под прямым углом по отношению к центральной спирали. Взаимное перемещение спиралей приводит к экспонированию части гидрофобных остатков, располагающихся в области контакта центральной спирали со спиралями В и С. Экспонирование этих остатков играет ключевую роль в образовании прочных контактов между тропонином С и тропонином I. Каждое из положений этой гипотезы проверялось с помощью точечного мутирования определенных остатков в структуре тропонина С. Были получены мутанты тропонина С, у которых взаимодействие спиралей С и D усиливалось за счет образования дополнительных электростатических контактов [ Fujimori, ea 1990 ]. Движение спиралей В и С относительно центральной спирали тропонина С ограничивалось за счет введения дисульфидной связи, пришивающей линкер между спиралями В и С к центральной спирали (спирали D) белка [ Grabarek, ea 1990 ]. Любой способ иммобилизации спиралей В и С-относительно, центральной спирали сопровождался заметным уменьшением сродства к Са2+ и почти полной потерей способности тропонина С регулировать АТРазную активность актомиозина или натяжение скинированных волокон. Как уже отмечалось, движение спиралей В и С относительно центральной спирали должно сопровождаться экспонированием гидрофобных остатков, что является энергетически невыгодным. Оказалось, что мутации V45T, M46Q, М48А, L49T, M82Q, приводящие к ослаблению гидрофобных контактов между спиралями В и D и облегчающие перемещение спирали В относительно спирали D, сопровождаются увеличением сродства регуляторных центров тропонина С к Са2+ [ Da Silva ea 1993 ].
Все приведенные результаты в полной мере согласуются с гипотезой Херцберга-Моулта-Джеймса [ Herzberg, ea 1986 ]. Окончательное подтверждение эта гипотеза получила в исследованиях последних лет, когда с помощью метода рентгеноструктурного анализа [ Houdusse, ea 1997 ] и ЯМР [ Slupsky, ea 1995 ] удалось установить структуру тропонина С, все центры которого насыщены ионами кальция. Действительно, в этом случае ориентация спиралей в N- и С-концевых доменах белка практически одинаковая. В отсутствие ионов Са2+ Са-связывающие центры находятся в так называемой закрытой форме. В этом состоянии гидрофобные остатки спиралей Са- связывающих петель контактируют друг с другом, скрыты от растворителя и при этом спирали Са-связывающих участков контактируют с центральной спиралью белка. В насыщенном ионами Са2+ состоянии спирали Са- связывающих участков удаляются от центральной спирали, гидрофобные остатки экспонируются растворителю и Са-связывающие центры переходят в так называемое открытое состояние. Все описанные события характерны для тропонина С скелетных мышц, все центры которого способны связывать Са2+. У тропонина С сердца из-за неконсервативных замен в первичной структуре первый центр потерял способность связывать Са2+ [ Kawasaki, ea 1994 ]. Тем не менее тропонин С сердца эффективно регулирует взаимодействие миозина с актином. Это означает, что второй центр тропонина С сердца играет главную роль в регуляции сокращения. Действительно, мутирование Glu-65 и выключение второго катионсвязывающего центра тропонина С сердца приводит к полной потере его регуляторных свойств [ Sweeney, ea 1990 ]. Этот факт может означать, что второй центр тропонина С сердца играет исключительно важную роль в регуляции сокращения. Простое выключение первого центра (мутации D27A, D29A) тропонина С скелетных мышц явно недостаточно для того, чтобы свойства тропонина С скелетных мышц оказались бы похожими на свойства тропонина С сердца [ Gulati, ea 1992 ]. Лишь замена первых 41 аминокислотного остатка тропонина С скелетных мышц на соответствующие остатки тропонина С сердца делает свойства химерного белка похожими на свойства тропонина С сердца [ Gulati, ea 1992 ]. В последнее время получены прямые свидетельства того, что индуцированные ионами Са2+ структурные изменения N-концевого домена тропонина С сердца существенно отличаются от аналогичных изменений, происходящих в структуре N-концевого домена тропонина С скелетных мышц. В обоих случаях второй центр обладает более высоким сродством к Са2+ и раньше насыщается ионами Са2+ [ Gagne, ea 1997 , Li, ea 1995 , Strynadka, ea 1997 ]. Только после этого становится возможным связывание ионов Са2+ первым центром. В ходе этого процесса происходит переориентация боковой цепи аминокислотного остатка, расположенного в положении 12 первого Са- связывающего центра (Glu-41 в тропонине С скелетных мышц). И лишь тогда становятся возможными перемещение спиралей и переход N-концевого домена из закрытого в открытое состояние. Тропонин С сердца (или тропонин С скелетных мышц с мутацией Е41А) не способен связывать Са2+ в первом центре. Поэтому вслед за связыванием Са+ во втором центре не происходит переориентации аминокислотного остатка, расположенного в положении 12 первой Са-связывающей петли, и вследствие этого N-концевой домен тропонина С сердца остается в закрытом состоянии [ Li, ea 1995 , Sia, ea 1997 , Spyracopoulos, ea 1997 ]. Как видно из рис.3 , насыщение N-концевого домена тропонина С скелетных мышц ионами Са2+ приводит к существенному перемещению спиралей В и С относительно спиралей N, А и D (левая и правая схемы на рис. 3 ). В то же время связывание Са2+ N-концевым доменом тропонина С сердца не приводит к существенному изменению структуры (левая и центральная схемы на рис. 3 ). Связывание Са2+ приводит к экспонированию гидрофобных остатков N- концевого домена тропонина С скелетных мышц [ Strynadka, ea 1997 ] и не влияет на доступность гомологичных гидрофобных остатков тропонина С сердца [ Spyracopoulos, ea 1997 ].
Таким образом, на изолированных белках Са2+ вызывает совершенно различные изменения в структуре тропонина С сердца и скелетных мышц. Несмотря на эти различия, обе изоформы тропонина С способны регулировать сократительную активность мышц. Предложено несколько объяснений этого противоречия. Известно, что тропонины С и 1 сердца взаимодействуют между собой слабее, чем соответствующие компоненты тропонина скелетных мышц [ Liao, ea 1994 ]. Это может быть связано с тем, что участки взаимодействия для компонентов тропонина сердца отличаются от таковых для тропонина скелетных мышц. Другое объяснение может заключаться в том, что после взаимодействия с тропонином I в структуре тропонина С сердца происходят существенные изменения, вследствие чего связывание Са2+ в N-концевом домене все-таки будет сопровождаться перемещением спиралей и открыванием N-концевого домена [ Sia, ea 1997 ]. Косвенным свидетельством в пользу последнего предположения являются данные о том, что после взаимодействия с тропонином I меняется окружение Met-81 тропонина С сердца [ Krudy, ea 1994 ].
Суммируя представленные данные, можно заключить, что связывание Са2+ сопровождается значительными изменениями в структуре тропонина С. Эти изменения могут передаваться на другие компоненты тропонинового комплекса.
Смотрите также:
