Тропонин C: трехмерная структура


Первые сведения о трехмерной структуре тропонина С появились в 1985 г., а детальная структура с разрешением 2 А была опубликована в 1988 г. [ Satyshur, ea 1998 , Herzberg, ea 1988 ]. До сих пор не удалось закристаллизовать тропонин С в отсутствие ионов Са2+. В то же время получены рентгеноструктурные данные для тропонина С, в котором два С-концевых [ Satyshur, ea 1998 , Herzberg, ea 1988 ] или все четыре центра (два N-концевых и два С-концевых) насыщены ионами кальция [ Houdusse, ea 1997 ].

По данным рентгеноструктурного анализа молекула тропонина С похожа на гантель, в которой два глобулярных домена содержат по два Са-связывающих центра. Эти два глобулярных домена соединены между собой длинной а-спиралью, формирующей ручку гантели ( рис. 1 ). Таким образом, по данным рентгеноструктурного анализа тропонин С имеет довольно симметричную вытянутую форму. Недавно опубликованные данные ЯМР высокого разрешения [ Slupsky, ea 1995 ] в целом согласуются с результатами рентгеноструктурного анализа. Однако если по данным рентгеноструктурного анализа два глобулярных домена тропонина С находятся на концах распрямленной и жесткой а-спирали, то по данным ЯМР глобулярные домены тропонина С могут достаточно свободно перемещаться друг относительно друга и это перемещение осуществляется за счет частичного плавления центральной спирали и формирования подвижного шарнирного участка в центре этой спирали ( рис. 2 ). Эти данные ЯМР согласуются с ранее опубликованными результатами малоуглового рентгеновского рассеяния [ Heidorn, ea 1988 ]. Многочисленные эксперименты, проведенные с использованием разных методик, также свидетельствуют в пользу того, что в растворе две глобулярные части тропонина С могут находиться на близком расстоянии друг от друга [ Grabarek, ea 1992 ]. Таким образом, в зависимости от условий молекула изолированного тропонина С может представлять собой либо распрямленную симметричную гантелеобразную структуру, либо довольно компактную структуру с двумя сближенными между собой глобулярными доменами.

Молекула тропонина С содержит в своем составе три основных компонента - два глобулярных домена и соединяющую их центральную а-спираль. Проанализируем каждый из этих элементов по отдельности. N-Концевой глобулярный домен тропонина С.

N-КОНЦЕВОЙ ДОМЕН ТРОПОНИНА С N концевой домен содержит два потенциальных катионсвязывающих центра. Сродство этих центров к ионам Са2+ (Ka 10#6 M-1) меньше сродства центров, расположенных в С-концевом домене тропонина С [ Potter, ea 1975 ], однако N-концевые Са-связывающие участки обладают высокой специфичностью. Они практически не связывают Mg2+ и поэтому обозначаются как Са- специфические участки низкого сродства. Высказывается предположение, что низкое сродство этих центров к Са2+ обусловлено тем, что в третьем положении Са-связывающей петли эти участки содержат остатки Gly и Ser, а Са-связывающие участки в С-концевой части тропонина С имеют в третьем положении Са-связывающих петель остатки Asp, которые более эффективны в координировании ионов кальция и могут участвовать в связывании магния [ Houdusse, ea 1997 ]. N-Концевой домен тропонина С сердца довольно сильно отличается от N-концевого домена тропонина С скелетных мышц по первичной структуре [ Kawasaki, ea 1994 ].

Второй Са-связывающий центр тропонина С сердца сохраняет сродство и специфичность, характерные для соответствующего участка тропонина С скелетных мышц [ Gusev, ea 1984 ].

Первый катионсвязывающий центр тропонина С сердца в силу неконсервативных замен и вставок потерял способность связывать катионы двухвалентных металлов [ Kawasaki, ea 1994 ]. N-Концевой домен тропонина С содержит пять а-спиральных участков. В дополнение к спиралям А и В, ограничивающим первый Са-связывающий участок, и спиралям С и D, ограничивающим второй Са-связывающий центр, N-концевой домен тропонина С содержит дополнительную а-спираль, расположенную на самом N-конце молекулы белка. Эта так называемая N-спираль играет важную роль в поддержании всей структуры N-концевого домена тропонина С. Удаление N- спирали приводит к уменьшению сродства катионсвязывающих центров к ионам Са2+ и ухудшению регуляторных свойств тропонина С [ Smith, ea 1994 ]. Особая роль принадлежит остатку Arg-11, который способен образовывать солевые мосты с Glu-16 (спираль А) и Glu-76 (спираль D). Точечная мутация R11A приводит к дестабилизации центральной спирали и ослаблению способности тропонина С регулировать взаимодействие миозина с актином [ Gulati, ea 1995 ].

В последние годы с помощью точечных мутаций исследована последовательность событий, происходящих при связывании Са2+ в N-концевом домене тропонина С. Обнаружено, что в тропонине С скелетных мышц первый участок обладает меньшим сродством к Са2+ , чем второй центр [ Gagne, ea 1997 , Li, ea 1995 , Li, ea 1997 ]. Это связано с тем, что из-за трех следующих друг за другом остатков Gly первая Са-связывающая петля обладает чрезмерной гибкостью и не может прочно связывать ионы кальция.

С-КОНЦЕВОЙ ГЛОБУЛЯРНЫЙ ДОМЕН ТРОПОНИНА C. В С-концевом домене тропонина С располагаются два центра, способных связывать как ионы Mg2+ (Ka=2*10#3 M-1), так и ионы Ca2+ (Ka=2*10#7 M-1) [ Potter, ea 1975 ]. Эти центры обычно обозначают как Са, Mg-центры высокого сродства. В состоянии расслабления при низкой концентрации Са2+ в миоплазме С-концевые участки тропонина С насыщены Mg2+. Константа скорости диссоциации Mg2+ из этих центров довольно низка (Koff = 8 с#-1), поэтому при инициации мышечного сокращения и повышении концентрации Са2+ в миоплазме ионы Mg2+ очень медленно заменяются на ионы Ca2+. В этой связи считается, что С-концевые центры тропонина С не могут непосредственно участвовать в регуляции мышечного сокращения, а выполняют определенную структурную роль, обеспечивая прикрепление тропонина С к белкам тонкого филамента [ Szczesna, ea 1996 , Malnic, ea 1998 ]. С этим выводом согласуются экспериментальные данные. Точечная мутация тропонина С, при которой первый аминокислотный остаток третьей и/или четвертой Са-связывающих петель (Asp) был заменен на Ala [ Szczesna, ea 1996 , Malnic, ea 1998 ], приводила к полной потере способности третьего и/или четвертого центра тропонина С связывать ионы Са2+. Тем не менее мутированные белки могли встраиваться в актиновый филамент, из которого предварительно удаляли интактный тропонин С и эффективно регулировали натяжение скинированных мышечных волокон [ Malnic, ea 1998 ]. Указанные мутанты не отличались от тропонина С дикого типа способностью регулировать взаимодействие миозина с актином, но взаимодействовали с белками тонкого филамента с пониженным сродством [ Malnic, ea 1998 ]. Особая роль в поддержании структурной стабильности тропонина С в тонком филаменте принадлежит третьему катионсвязывающему центру [ Malnic, ea 1998 ]. В отличие от N-концевого домена, где связывание Са2+ сопровождается лишь переориентацией уже сформированных элементов вторичной структуры [ Grabarek, ea 1992 ], связывание Са2+ в С-концевом домене приводит к формированию дополнительных участков а-спирали и образованию b-складки между третьим и четвертым катионсвязывающими центрами белка [ Brito, ea 1993 ]. В состоянии расслабления С-концевые центры тропонина С насыщены Mg2+ , связывание которого также влияет на структуру тропонина С. В настоящее время нет сомнений в том, что катионсвязывающие центры С-концевого домена играют важную роль в поддержании структуры тропонина С и в его встраивании в тонкий филамент.

ЦЕНТРАЛЬНАЯ а-СПИРАЛЬ ТРОПОНИНА С. Глобулярные домены тропонина С соединены между собой длинной а-спиралью ( рис. 1 ). Было высказано предположение, что эта спираль играет важную роль в передаче конформационных сигналов между двумя Са-связываюшими глобулярными доменами тропонина С [ Sundaralingam, ea 1985 ]. Для проверки этого предположения была синтезирована серия мутантов тропонина С, содержащих либо точечные мутации, либо вставки или делеции нескольких аминокислотных остатков в центральной спирали. Удаление трех, четырех или семи аминокислотных остатков в центральной спирали не сопровождалось заметными изменениями в свойствах тропонина С [ Babu, ea 1993 ]. Указанные делеции не сопровождаются значительными изменениями ориентации глобулярных доменов белка друг относительно друга. Удаление двух остатков центральной спирали сопровождается поворотом глобулярных доменов белка на 180 друг относительно друга. Такая переориентация глобулярных доменов сопровождалась некоторыми изменениями способности тропонина С регулировать взаимодействие миозина с актином [ Dobrowolski, ea 1991 ]. В последнее время были получены мутанты с делецией 11 или даже 12 остатков в центральной спирали [ Babu, ea 1993 ]. Такое существенное уменьшение длины центральной спирали не приводило к существенным изменениям в параметрах связывания ионов Са2+, однако подобные мутанты были неэффективны в регуляции актомиозиновой АТРазы . Эти мутанты, однако, были склонны к димеризации и в димерном состоянии оказывались способными регулировать взаимодействие миозина с актином.

Описаны мутанты тропонина С с удлиненной центральной спиралью. При этом удлинение достигалось за счет дополнительных витков а-спирали либо введения девяти остатков Pro или девяти остатков, формирующих хаотический клубок [ Ramakrishnan, ea 1996 ]. Включение кластера остатков Pro или длинного хаотического клубка сопровождалось значительным ухудшением способности тропонина С регулировать АТРазную активность актомиозина. Таким образом, можно заключить, что центральная спираль скорее всего выполняет функции полужесткого шарнира, соединяющего глобулярные домены тропонина С. Кроме того, центральная часть может участвовать в передаче сигнала между глобулярными доменами [ Szczesna, ea 1996 ]

Смотрите также:

  • ТРОПОНИН C