Рекомбинация ДНК-содержащих вирусов
Вирусы, геном которых представлен ДНК, используют при рекомбинации, в отличие от РНК-содержащих вирусов, те же механизмы, которые лежат в основе перестроек клеточного генома. Это, прежде всего, механизм разрыва и воссоединения двунитевой ДНК.
Первыми семействами ДНК-содержащих вирусов, у которых рекомбинация была зарегистрирована, а затем детально проанализирована, оказались семейства Adenoviridae , Herpesviridae и Poxviridae . Для этих семейств наиболее полно описаны феноменология и механизмы ДНК-рекомбинации.
Важную роль в исследовании рекомбинации сыграло обнаружение образования рекомбинантов между аденовирусом и вирусом SV40 , относящимся к семейству Polyomaviridae , т.е. двумя неродственными ДНК-содержащими вирусами. Присутствие части генома вируса SV40 в вирусных частицах аденовируса типа 7 было сначала выявлено по косвенным признакам, причем первоначально предполагали, что в препаратах вируса содержится ДНК SV40, заключенная в аденовирусный капсид. Однако оказалось, что имеет место рекомбинация, при которой участок аденовирусной ДНК замещен отрезком ДНК SV40, соответствующей 75% генома этого вируса. В дальнейшем были получены разнообразные рекомбинанты, содержавшие участки аденовирусной ДНК и ДНК SV40 в разных соотношениях и разной локализации, в том числе недефектные вирусные частицы, включавшие полный геном аденовируса и участок генома SV40. Рекомбинанты аденовируса с SV40 нашли широкое применение при картировании геномов обоих вирусов.
Не менее важное значение для исследования структуры аденовирусного генома имело получение рекомбинантов межу разными аденовирусами. Впервые возможность такой рекомбинации была продемонстрирована возможность реассортации между аденовирусами человека и обезьян. В дальнейшем для исследования структуры аденовирусного генома было применено двухфакторное скрещивание между ts-мутантами аденовирусов 5-го типа. У ts-мутантов аденовирусов корреляция между частотой рекомбинации и расстоянием между мутациями в геномной ДНК выражено достаточно четко, но эта корреляция характерна только для точечных мутантов, к которым относятся в основном ts-мутанты. У мутантов, имеющих делении и вставки, эта корреляция нарушена, что связывают с изменением частоты ошибок ДНК-полимеразы, ведущих к актам рекомбинации в области делеций и вставок. Рекомбинация у аденовирусов тесно связана с процессом репликации ДНК, при котором у вирусов этого семейства одна из нитей двуспиральной ДНК вытесняется из дуплекса новообразованной нитью. Эта вытесненная однонитевая ДНК может связываться с комплементарными участками в районе расплетания нитей реплицирующейся ДНК, что и ведет к обмену участками генома, причем в процессе разрыва и восстановления связей принимают участие репарационные механизмы клетки.
У большинства вирусов семейства Herpesviridae (в частности, у всех вирусов подсемейства Alphaherpesvirinae ) рекомбинация является необходимым компонентом процесса репликации генома. В отличие от ретровирусов , у которых связь репликации с рекомбинацией обусловлена использованием механизма смены матриц при репликации , у многих вирусов семейства Herpesviridae в линейной двунитевой геномной ДНК имеется два участка - L-участок и S-участок , находящихся в разных молекулах ДНК в разной взаимной ориентации. Между участками, а также на конце участка S есть инвертированные повторы - соответственно внутренний ( IR инвертированный повтор ) и концевой ( TR инвертированный повтор ). Именно наличие повторов обеспечивает осуществление инверсий взаимной ориентации участков L и S в ходе репликации ДНК, причем эти инверсии происходят в результате актов рекомбинации между инвертированными повторами.
Репликация генома альфа-герпесвирусов протекает в клеточном ядре. Она начинается с циркуляризации линейной вирусной ДНК, после чего кольцевой геном служит матрицей для синтеза новых геномных ДНК, осуществляемого по типу "катящегося кольца", в результате чего образуется очень большая, конкатемерная ДНК, содержащая много геномных последовательностей, ковалентно связанных конец в конец. Некоторые из этих конкатемерных структур могут быть не линейными, а ветвистыми. Конкатемеры разрезаются на отдельные геномные ДНК. Инверсия взаимной ориентации участков генома, осуществляемая посредством разрывов и воссоединений ДНК на участках инвертированных повторов, происходит уже на стадии образования конкатемерных структур.
При смешанной инфекции этот процесс ведет к образованию рекомбинантных вирусов. Такая рекомбинация осуществляется по механизму гомологичной рекомбинации, требующей значительного сходства последовательностей ДНК скрещиваемых вирусов в области рекомбинационного события. Поэтому между близкородственными вирусами (например, разными штаммами вируса герпеса человека , ВПГ-1) она происходит с высокой частотой (до 30%). Между более отдаленно родственными вирусами (например, ВПГ-1 и ВПГ-2 ) рекомбинации происходят с намного меньшей частотой, а между еще более отдаленными, такими как герпесвирус крупного рогатого скота (КРС) 1-го типа (BoHV-1) и герпесвирус коз 1-го типа (CpHV-1) , не происходят вовсе.
Однако гомологичная рекомбинация, в механизме которой важную роль играет сходство последовательности нуклеотидов в ДНК вирусов-родителей, не является единственным типом рекомбинации у Herpesviridae . Наблюдается, хотя и со значительно меньшей частотой, и негомологичная (или "незаконная") рекомбинация, при которой гомология нукпеотидных последовательностей не имеет значения. Сопоставление нуклеотидных последовательностей ДНК разных герпесвирусов показывает, что оба типа рекомбинации, гомологичная и негомологичная, сыграли существенную роль в эволюции вирусов этого семейства.
У вирусов семейства Poxviridae репликация осуществляется в цитоплазме. Это ограничивает возможности участия клеточных механизмов в процессах рекомбинации. Рекомбинация у Poxviridae возникает в результате образования гетеродуплексов, причем отсутствие процесса репарации в цитоплазме повышает вероятность того, что формирование гетеродуплекса приведет к рекомбинации. Молекулярный механизм рекомбинации у Poxviridae тесно связан с инициацией репликации, которая у вирусов этого семейства начинается со сложной перестройки конца линейной молекулы ДНК. У Poxviridae две нити ДНК соединены на конце дуплекса ковалентной связью и в концевой области имеется несколько прямых повторов . Для начала репликации необходимо возникновение разрыва в одной из нитей ДНК в районе повторов, приводящего к разворачиванию концевой шпильки и к удлинению дуплекса путем достройки второй нити на развернутом участке. В дальнейшем в этом районе образуется репликативная вилка. Именно на начальной стадии репликации может иметь место гетеродуплекс, ведущий к образованию рекомбинантного генома.
Смотрите также:
