Анализ данных ПЦР в реальном времени
Кривая амплификации показывает увеличение концентрации ампликонов в образце, в процессе амплификации увеличивается и величина RN - нормированный сигнал репортерного красителя (частное деления сигнала флюоресценции и флюоресцентного сигнала пассивного контроля ( рис. 2.49 ).
На стадии I можно выразить отношение концентрации продукта ПЦР к концентрации матрицы следующим упрощенным кинетическим уравнением:
Nс = Nо[(1+ E) в степени C],
где Nс - концентрация амплифицированного продукта в каждом цикле ПЦР; Nо - исходная концентрация матрицы; Е - эффективность системы; С - номер цикла.
Важным является определение порогового цикла Ст - номер первого цикла, в котором происходит увеличение флюоресцентного сигнала репортерной группы по сравнению с уровнем фонового сигнала. Его величина зависит от исходного количества копий матрицы и от эффективности амплификации ДНК. Базовую линию можно определить по умолчанию как точку на кривой амплификации, в которой величина dRn равна значению порогового цикла, составляющего 0,2. Базовую линию можно также выставить вручную.
Для количественного анализа необходим стандарт (произвольный фрагмент ДНК или РНК, ограниченный теми же праймерами, что и в специфической ПЦР-системе). К каждому стандарту конструируется соответствующий зонд. Делают 10-кратные разведения стандарта и проводят ПЦР в реальном времени с использованием данных разведений. После проведения ПЦР и построения калибровочной зависимости величины Ст от исходного количества копий стандартов (lgN) для каждого из стандартов можно вычислить неизвестное исходное количество копий в анализируемых образцах с помощью интерполяции.
Преимущества ПЦР в реальном времени.
- Информацию о составе пробы и о ходе реакции можно получить, не открывая пробирку. Это ускоряет получение результата, снижает опасность контаминации. Наличие специфического зонда, комплементарного внутреннему участку фрагмента, дополнительно проверяет специфичность полученного фрагмента, снижает риск получения ложноположительных результатов.
- Регистрация интенсивности флюоресценции позволяет судить о количестве в пробе исходного инфекционного агента.
- Возможность проводить так называемую множественную ПЦР, т.е. регистрировать в одной реакции несколько инфекционных агентов, используя различные флюоресцентные красители.
ПЦР в реальном времени проводят в особых приборах. Прибор представляет собой амплификатор, совмещенный с флуориметром. В процессе ПЦР происходит считывание результатов амплификации. Единственным препятствием широкого использования ПЦР в реальном времени является довольно высокая стоимость прибора, поэтому метод применяют пока лишь в небольшом количестве лабораторий. Однако в настоящее время появляется все больше приборов отечественного производства, стоимость которых существенно меньше зарубежных, а также тест-систем на основе ПЦР в реальном времени для определения вирусных и бактериальных патогенов. Нет сомнения, что ПЦР в реальном времени получит развитие в будущем.
Смотрите также:
