Выбор праймеров
При выборе праймеров необходимо пользоваться предназначенными для этого компьютерными программами, а не выбирать их на глаз по последовательности. Рекомендуется, чтобы З'-концевой нуклеотид прямого праймера приходился на второй нуклеотид кодона, а обратного - на первый (для кодирующих белки участков генома вируса). Это повышает вероятность хорошего взаимодействия праймеров с матрицей и их эффективность при проведении ПЦР .
При выборе между вырожденным праймером и праймером с риском некоторых замен относительно последовательности генома вируса приоритет должен быть за первым вариантом, если основной целью является получение фрагмента ПЦР и праймер не предполагается использовать для дальнейшего секвенирования. Если праймер необходимо использовать для секвенирования, то выбор должен быть за вторым вариантом.
При подборе праймеров возникает вопрос: расположить их подальше друг от друга, чтобы фрагмент ПЦР был длиннее, или привязывать праймеры к консервативным участкам генома? Следует выбрать первое, если в распоряжении находится достаточно близкая последовательность к исследуемой, и второе, если подбор праймеров ведется на основе последовательностей, весьма удаленных от исследуемого генома.
При любом варианте стартовой точкой проекта должна быть максимально достоверная последовательность вирусного генома независимо от места ее нахождения. В оптимальном случае это участок генома с определенной ранее последовательностью, в другом - наиболее консервативный участок генома данного вируса. Следует обратить внимание на то, что концевые последовательности вирусных геномов достаточно часто консервативны внутри группы родственных вирусов.
Пилотной задачей проекта всегда является получение хотя бы небольшой достоверной нуклеотидной последовательности изолята, для которого планируется определение полной последовательности генома. Это позволяет подтвердить правильность отношения вируса к данной группе, найти максимально гомологичную родственную последовательность в базе данных (использовать ее в дальнейшем для сравнения и выбора праймеров) и подобрать хотя бы один праймер для дальнейшей работы, в котором можно быть полностью уверенным.
В качестве примера двух вариантов работ по определению полной нуклеотидной последовательности генома можно привести проекты по вирусу птичьего гриппа AH5N1 и вирусу лихорадки Западного Нила .
Исходным материалом в обоих случаях являлся культуральный вирус с высоким титром, что позволяло получать фрагменты ПЦР длиной до 5000 п.н. Возможности аппаратного секвенирования были идентичными для обоих проектов и позволяли достоверно определять нуклеотидную последовательность до 800-900 п.н. от праймера.
Исходные данные о последовательности исследуемых изолятов отличались радикально: если в случае вируса гриппа A субтипа H5N1 в распоряжении имелся небольшой участок последовательности гена гемагглютинина , позволивший обнаружить в базе данных полную нуклеотидную последовательность практически идентичного штамма; то в случае вируса лихорадки Западного Нила доступны были только две полных геномных последовательности (как выяснилось впоследствии, других генотипов вируса) и последовательности родственных вирусов, входящих в группу японского энцефалита .
Смотрите также:
