Двухфакторное скрещивание вирусов
Для скрещивания используют вирусы, различающиеся по каким-либо признакам. Их называют вирусами-родителями. Гибридные вирусы ( рекомбинанты или реассортанты ) должны обладать признаками обоих родителей. Во многих случаях, однако, скрещивание проводится так, что регистрируется не наличие, а отсутствие родительских признаков. Такая ситуация возникает при использовании условно-летальных мутантов в качестве вирусов-родителей. Широко используются в генетических опытах ts-мутанты, т.е. условно-летальные мутанты , не способные размножаться при повышенной температуре. Если клетка заражена двумя ts-мутантами, у которых мутации, сообщающие им температурочувствительный фенотип, расположены в двух разных участках генома, при непермиссивной для мутантов температуре будут размножаться и накапливаться лишь такие вирусы, которые получили от каждого из родителей ту часть генома, в которой нет мутации.
У вирусов с несегментированным геномом такие вирусы могут возникнуть только в результате рекомбинации . Чем дальше друг от друга находятся в геноме мутантов нуклеотидные замены, дающие мутацию, тем более вероятным оказывается возникновение рекомбинанта. Поэтому скрещивание ts-мутантов может применяться (и широко применялось) при составлении генетических карт вирусных геномов. Обычно скрещивание для определения вероятности рекомбинации проводят путем совместного заражения клеток в условиях достаточно высокой множественности, чтобы все клетки были заражены одновременно. Затем часть клеточных культур инкубируют при пермиссивной температуре, а часть - при непермиссивной. По соотношению накопления вируса при пермиссивной и непермиссивной температуре определяют процент температуроустойчивых рекомбинантов и частоту рекомбинации. Чем выше частота, тем дальше друг от друга расположены мутации, причем эти дистанции должны быть аддитивны, т.е. при суммировании расстояния между мутациями A и В с расстоянием между мутациями В и С должно получаться расстояние между мутациями A и С. Такая схема картирования называется двухфакторным скрещиванием.
Для генетического анализа вирусов с сегментированным геномом тоже может использоваться двухфакторное скрещивание. В этом случае оно применяется для того, чтобы определить, находятся ли две мутации в одном и том же геномном сегменте или в разных. Картирование взаимного расположения мутаций и определение расстояния между ними возможно и у вирусов с сегментированным геномом, но только в том случае, если мутации находятся в пределах одного геномного сегмента.
Для двухфакторного скрещивания могут использоваться не только ts-мутанты, но и другие условно-летальные мутанты. В качестве непермиссивных условий можно использовать присутствие какого-либо антивирусного препарата. В этом случае в результате рекомбинации будут возникать не температуроустойчивые рекомбинанты, а рекомбинанты, устойчивые к действию препарата. В качестве селективных условий может использоваться и круг хозяев вируса, как это было сделано при скрещивании аденовирусов человека с аденовирусами обезьян.
В тех случаях, когда вероятность образования рекомбинантов или реассортантов очень высока, селективные условия могут использоваться не на стадии смешанного заражения, а при анализе потомства. В этих случаях смешанное заражение проводят в пермиссивных условиях, а затем вирусное потомство анализируют, определяя наличие или отсутствие маркера у вирусных клонов, полученных методом бляшек. При этом варианте анализа можно изучать генетические взаимодействия не условно-летальных мутантов, а вирусов, различающихся по каким-либо иным признакам, например таким, как антигенная специфичность вирусных белков.
Смотрите также:
