Коллекционирование вирусов: лиофилизация
Основной закономерностью анабиоза лиофилизированных вирусов, хламидий и прионов является то, что отмирание вирионов, инфекционных телец и белков происходит однотипно для всех представителей одного семейства и зависит не только от консерванта-наполнителя и режима лиофилизации, но и от постоянства минусовой температуры длительного хранения и вакуума сосуда хранения (ампулы или флакона), в котором должны полностью отсутствовать условия для развития процессов окисления.
Как известно, техника лиофилизации складывается из следующих операций: 1) подготовка ПБА (патогенный биологический агент) суспензии к лиофилизации; 2) выбор защитной среды; 3) режим высушивания; 4) остаточная влажность и укупорка ампул.
ПБА - вирусы , прионы , хламидии - должны быть очищены только от балласта клеток и их обрывков центрифугированием при 2000 об./мин в течение 10 мин и 10000 об./мин - 5 мин. Более высокая степень очистки с помощью ультрацентрифуг не требуется, потому что подвергать лиофилизации чистые вирионные взвеси нельзя - они погибают при лиофилизации, незащищенные белком.
Защитные среды при лиофилизации играют роль буфера, обеспечивающего равномерное обезвоживание в процессе сушки всех компонентов, давая защитный эффект при воздействии на ПБА экстремальных факторов замораживания, лиофилизации и последующего хранения, что достигается путем лиофилизации физико-химической структуры суспензии с помощью защитной среды, не образующей с ПБА химически прочных связей. При этом жесткость белковых структур повышается за счет перераспределения молекулярного окружения ПБА в среде высушивания и, в первую очередь, за счет повышения энергии связи воды, т.е. снижения запаса свободной воды в системе. Сравнительная оценка безбелковых защитных сред (лецитин, тиомочевина, натрия сульфат, полиалкоголин, поливинилпиралидон, полиэтиленоксид, сахара - сахароза, сорбит) показала, что они могут положительно воздействовать на процесс лиофилизации ПБА, но отрицательно действуют на процесс последующего хранения сухих вирусов, прионов и хламидий при температуре от +4 до -20*С. При этом ПБА погибают в течение 2-3 лет хранения. Белковые и комбинированные белково-углеводные защитные среды благоприятно действуют не только на процесс лиофилизации, но и на последующее хранение, давая возможность сохранять лиофилизированные культуры вирусов, прионов и хламидий десятки лет при минусовых температурах.
Большинство исследователей, рекомендуют защитные белковые или белково-углеводные среды, созданные на базе сред культивирования, как дающие повышенный стабилизирующий эффект. Мозговые суспензии мышей, аллантоисные культуры куриных эмбрионов с ПБА можно успешно лиофилизировать и хранить без консервантов. Здесь надо отметить отрицательный эффект желтка куриного эмбриона как консерванта. Проведенные исследования показали, что добавление 2,5-25% желтка в ПБА-суспензии дает отрицательный эффект при лиофилизации и при последующем хранении при минусовой температуре. ПБА (хламидии) при этом отмирают в течение года. Изучены многие белково-углеводные консерванты и получена рекомендация для вирусов, прионов и хламидий - это смесь в конечном разведении 1% желатины или желатозы и 5-10% сахарозы или сорбита.
Режим высушивания также имеет большое значение при лиофилизации ПБА. Прежде всего, необходимо учитывать к какой группе патогенности относится ПБА. Объект высушивания, относящийся ко II группе патогенности, требует специального защитного блока и качественной защиты сотрудников, проводящих лиофилизацию. Должны всегда быть проведены комплексы защитных мероприятий и обязательно установлены фильтры тонкой очистки в сушильных аппаратах на выходе на мотор - фильтры Петрянова.
Большую роль при лиофилизации для последующего хранения играет остаточная влажность. Оптимальной остаточной влажностью высушенного ПБА считается значение 1-3%. При розливе ПБА в ампулы БЦЖ-6 можно добавить 0,5-1,0 мл, а в ампулы БЦЖ-2 или инсулиновые флаконы - не более 0,2 мл.
Поскольку вирусы, прионы и хламидий в основном подчиняются единым законам консервации, о лиофилизации их можно подробно прочитать у [ Фадеевой с соавт., 2004. Основные принципы. ].
Смотрите также:
