Коллекционирование вирусов: чистота ПБА
Вопрос чистоты вирусных культур и других ПБА , а также систем и сред культивирования штаммов в отношении контаминирующих агентов является одним из главных в коллекционной работе, т.к. влияет на оценку основных биологических характеристик штамма.
Контаминантами коллекционных культур могут быть бактерии, простейшие, микрогрибы, микоплазмы, спонтанные хламидий и вирусы. Каждый штамм перед депонированием, в момент депонирования или ранее поступивший в ГКВ испытывается на возможное присутствие контаминантов и обязательно очищается от них. После этого очищенный пул штамма консервируется методом лиофилизации и параллельно с авторским закладывается на длительное хранение при минусовых температурах -20, -40 или -60*С. Подробно методы диагностики и очистки коллекционных культур от контаминантов описаны в Методическом пособии [ Фадеева и др. 2004. Методическое пособие по диагностике ]. Здесь приводится действие антибиотиков на различные контаминанты, которые чаще всего встречаются при депонировании штаммов в ГКВ ( табл. 2.19 ).
Особенно трудно и ответственно работать по диагностике и очистке от контаминантов - онковирусов и других спонтанных вирусов, которые могут присутствовать в производственных штаммах.
Действующее в настоящее время требование ВОЗ предусматривает полное отсутствие посторонних агентов в профилактических препаратах, а следовательно, и в производственных штаммах вирусов. Современная схема позволяет выявлять вирусы, вызывающие в производственных штаммах выраженные изменения. Многие вирусы человека и животных могут вызывать латентную или хроническую форму инфекции как in vitro, так и in vivo. В процессе персистенции вирусов в организме или клеточных культурах могут происходить изменения многих свойств, в т.ч. и патогенных. Важно отметить, что изменения вируса-контаминанта могут быть так глубоки, что их не удается обнаружить обычными методами.
Обязательно проводится выявление онковирусных и других контаминантов в производственных штаммах вирусов, а также в системах и средах, на которых они пассируются. Для проведения этих комплексных исследований необходимо знать историю получения клеток и основного ингредиента питательной среды - сыворотки. Если в системе задействованы:
1) КРС, телята, сыворотка - надо осуществлять пробы на вирусы вирусы парагриппа типа 3 , вирусы ринотрахеита , вирусы диареи ;
2) куриные эмбрионы, фибробласты куриных эмбрионов - пробы на вирусы лейкозов , вирусы миелобластоза и другие онкогенные вирусы птиц ;
3) обезьяны, клетки почек зеленой мартышки - пробы на герпесвирусы , ЦМВ обезьян ;
4) человек, фибробласты эмбриона человека и др. - пробы на HBsAg , HTLV , гепатит С и ВИЧ .
Общие исследования культур на наличие характерных цитопатогенных изменений (ЦПД, симпластообразование, трансформация и т.д.) проводятся через каждые 5-10 пассажей. Перед исследованием вируссодержащих клеточных культур их центрифугируют в течение 10 мин при 1000 об./мин. Эту жидкость исследуют как антиген с набором гипериммунных сывороток к различным типовым штаммам вирусов, при этом определяют возможные контаминанты в зависимости от характера и истории клеточной культуры. Все типовые и производственные штаммы вирусов, хранящиеся десятки лет в ГКВ , не имеют контаминантов, т.к. они деконтаминированы авторами при депонировании, лиофилизированы и хранятся без пассажей.
ГКВ функционирует на базе ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН с момента организации института. Согласно приказу министра здравоохранения СССР (приказ N205а, 1956 г.), утвержден статус ГКВ и ее устав. В 1993 г. приказом Минздрава РФ был подтвержден статус ГКВ с утверждением нового "Положения о Государственной коллекции вирусов II-IV групп патогенности". Статус ГКВ также подтвержден и зафиксирован в постановлении Правительства РФ за подписью Председателя Правительства N725-47 от 24.06.1996 г., в котором ГКВ признана народным достоянием и утверждена необходимость создания условий сохранения вирусного генофонда. ГКВ зарегистрирована в Международных коллекционных центрах ВОЗ с функциями информационного центра, депозитария и выдачи штаммов, в т.ч. производственных, и является национальным достоянием России, имеет международное значение.
Смотрите также:
