Криоэлектронная микроскопия
Методы негативного контрастирования и реплик обеспечивают высококонтрастное изображение поверхности биологических объектов, но разрешение этих методов ограничено размерами частиц металла, образующего тень, либо молекул красителей, состоящих из солей тяжелых металлов. Метод крио электронной микроскопии позволяет наблюдать с высоким разрешением (около 7Е) структуру вирионов в гидратированном состоянии, исключая какой-либо контрастер и шумящую подложку, а затем осуществлять трехмерную реконструкцию их капсидов.
Исследуемый образец обычно представляет собой концентрированную суспензию (0,05-5,0 мг/мл) высокоочищенного вируса. Примерно 5 мкл этой суспензии наносят на ЭМ-сеточку, покрытую перфорированной угольной пленкой с отверстиями диаметром 1-5 мкм. Избыток жидкости удаляют, оставляя тонкий слой вируссодержащей суспензии (1000-2000 Е), перекрывающий отверстия подложки. Затем сеточки с помощью специального устройства погружают в жидкий пропан или этан. При этом скорость замерзания суспензии достигает 10*/с, что достаточно для аморфизации вируссодержащей жидкости. Для наблюдения образцов ПЭМ снабдили термостатированным предметным столиком, охлаждаемым до температуры -150*С, на который помещают сеточку с замороженным материалом. При исследовании образцов в крио-ПЭМ пленка аморфизированной жидкости дает практически бесструктурный фон, на котором видны вирусные частицы со всеми особенностями их строения. Для трехмерной реконструкции вирусных капсидов, обладающих кубической симметрией, объединяют информацию от изображений частиц, находящихся в разной ориентации, и затем осуществляют расчет пространственной структуры по специальным программам.
Смотрите также:
