Методы обратной генетики: общие сведения
В последнее десятилетие в литературе по вирусологии появился термин "reverse genetics" ("обратная генетика" - ОГ). В 4-м издании "Fields Virology" этот термин связывают с внесением мутаций в РНК-геномы вирусов, в ходе чего РНК переводится в форму кДНК (созвучно с "обратной транскрипцией"). Вносить целенаправленные изменения в РНК технически затруднительно, однако возможно получение кДНК с необходимыми изменениями, на основе которой получают измененную РНК. Схематично это выглядит так: вирус->РНК-геном->кДНК->измененная кДНК->измененный РНК- геном->измененный вирус.
Теперь можно манипулировать генами вируса: вносить мутации, добавлять или сокращать генетическую информацию. Измененный на стадии кДНК генетический материал снова переводится в формат РНК, затем на его основе получается вирус с измененным генетическим материалом. Такой продукт (вирус) отличается от исходного вируса не случайными, а целенаправленно внесенными мутациями.
Новый вирус можно получать многократно из хорошо сохраняемого и безопасного генетического материала, а не из замороженного или лиофилизированного препарата вируса (генетически негомогенного), т.е. имеется как бы генетическая "заготовка" для вируса или его измененных вариантов - с нее стабильно будет получаться один и тот же продукт с точно известным генным содержанием.
В научной литературе сегодня встречается термин "создание системы обратной генетики" для того или иного вируса. Сюда входит создание матрицы кДНК, в которую можно вносить изменения и получать полный инфекционный РНК-геном вируса и затем сам вирус. Этот рекомбинантный геном определяют также термином "инфекционный клон".
Описанная выше логика применима и к созданию неполных геномов, функционирование которых следует поддерживать внешними факторами. Эти работы также относят к ОГ.
Таким образом, ОГ можно определить как методический прием, посвященный воссозданию, конструированию функционального генетического материала, основанный на получении двух основных компонентов: 1) функционального генетического материала (мини-геном, полный геном); 2) экспериментальных условий для его функционирования.
Такая модель позволяет вносить изменения как в генетический материал, так и в факторы, влияющие на его функции. Она представляет собой инструмент для прямой экспериментальной проверки рабочих гипотез о молекулярных механизмах наследственности. С практической точки зрения возможность манипуляции вирусной генетической информацией может быть использована для: 1) изучения генетики вирусов и роли каждого гена, каждого генного участка, каждого фактора, влияющего на функции генов; 2) создания новых полезных штаммов, например вакцинных штаммов и на их основе - вакцин; 3) создания новых вредных штаммов, например высокопатогенных для человека, животных и растений, а на их основе - биологического оружия.
ОГ известна с 1990-х годов, расцвет ее приходится на настоящее время. Развитие ОГ можно условно разделить на три этапа: на первом этапе была получена сама возможность воспроизводить РНК-содержащие вирусы на основе их рекомбинантных геномов, так называемых инфекционных клонов. Этот этап, в основном, позади, сам факт создания системы ОГ для того или иного РНК-вируса уже не является научным событием, это рутинный лабораторный прием. Даже для очень сложных моделей, таких как коронавирусы или вирус гриппа, эти системы созданы, хотя и в единичных лабораториях.
На втором этапе происходит активное применение полученных моделей для накопления информации о РНК-содержащих вирусах. Сегодня среди основных приемов вирусолога - изменение генетической информации вирусов и одновременно изменение факторов, влияющих на регуляцию генов или иные вирусные функции. Подобная постановка эксперимента способна с судебной точностью доказать связь между генетическими детерминантами и вирусными функциями и постепенно расшифровать сложные механизмы вирусной генетической регуляции. Этот, второй, этап сейчас набирает обороты. Обобщение и осмысление новой информации приведет к интенсивному развитию третьего этапа.
На третьем этапе будет изменяться вирусная генетическая информация с целью получить новые вирусные штаммы с заданными свойствами. Этот этап только начался, манипуляции с вирусами не выходят за рамки наших сегодняшних знаний, но уже впечатляют: у вирусов заменяют поверхностные антигены, получают целенаправленно реассортанты вирусов гриппа (теперь уже и мутанты) для создания эффективных вакцин, гибриды между родственными вирусами для преодоления межвидового барьера или тканевого тропизма. Для коронавирусов придумана пересадка генов с тем, чтобы при случайной рекомбинации вакцинного штамма такой неконтролируемый рекомбинант не "выжил" бы.
Разработаны системы ОГ для вируса бешенства , вируса кори , вируса гепатита С , вируса гриппа , вируса РСВ-инфекции человека , вируса парагриппа , метапневмовируса человека , вируса чумы плотоядных , вируса классической чумы свиней , вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней , вируса чумы КРС и вируса диареи КРС , вируса болезни Ньюкасла , вируса инфекционного бурсита кур , вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней и целого ряда других.
Система ОГ для вируса гриппа состоит из многих компонентов (как и генетическая информация данного вируса). Возможность лабораторной замены и модификации этих компонентов отражает генетическое многообразие вирусов гриппа. Для создания вакцинного штамма будут брать компоненты с такими же свойствами, как у пандемического штамма. Это позволит быстро реагировать на возникающие угрозы путем создания вакцин с заданной специфичностью.
В ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского разработаны системы ОГ для РСВ-инфекции человека, классической чумы свиней, репродуктивно- респираторного синдрома свиней. На базе вируса классической чумы свиней в 2003-2004 гг. создан новый вакцинный штамм с замененным генетическим материалом из вируса диареи крупного рогатого скота для маркированного вакцинирования.
Смотрите также:
